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miR-99a在泌尿系肿瘤中的研究进展
微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA,广泛存在于动植物细胞体内,在人体内负责调控将近1/3的基因,参与到某些人类肿瘤形成的过程中。近年来,关于微小RNA家族在多种人类肿瘤中的研究越来越频繁。 miR-99a(microRNA-99a)属于miR-99家族,在多种人类恶性肿瘤中呈现低水平表达。该文简单回顾了miR-99a的近期相关研究,并主要通过文献复习了其在泌尿系统三大肿瘤：膀胱癌、肾癌、前列腺癌中的一些研究进展,发现miR-99a在膀胱癌、肾癌、前列腺癌组织或其肿瘤细胞中均呈低表达,并且通过质粒转染等方法上调其在肿瘤细胞中的表达后发现其高表达能抑制肿瘤的生长,可展望其对于泌尿系肿瘤的诊断、治疗、预后的潜能。
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MiR-99a调控CTDSPL影响儿童急性髓性白血病细胞增殖及凋亡
目的 探讨miR-99a对儿童急性髓性白血病(AML)的影响及其作用机制,为寻找新的靶向治疗方法提供理论依据.方法 用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测57例AMLL患儿及10例对照患儿的骨髓标本中miR-99a的表达;在细胞系水平通过对miR-99a过表达或抑制表达,利用MTT细胞增殖及双染凋亡试验研究miR-99a对AML细胞增殖、凋亡的影响.用在线软件预测miR-99a可能的靶基因,并通过双荧光报告及蛋白印迹技术对其靶基因进行验证.结果 miR-99a在AML患儿初诊时高表达,在完全缓解(CR)时低表达;miR-99a促进AML细胞的增殖,抑制其凋亡;采用双荧光报告及蛋白印迹技术在细胞系中验证出CTDSPL可能是miR-99a的靶基因;并通过蛋白印迹技术在AML患儿标本中验证出miR-99a抑制CTDSPL蛋白的表达.结论 miR-99a通过靶向负调控CTDSPL基因影响AML细胞增殖及凋亡,靶向抑制miR-99a表达可能成为治疗AML的一个新策略.
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miR-99a对宫颈癌Hela细胞增殖影响机制研究
目的 miR-99a在宫颈癌等多种肿瘤组织中异常表达,且与肿瘤细胞的多种生物学行为密切相关.本研究旨在探讨miR-99a沉默HOXA1表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖的影响及相关机制.方法 通过瞬时转染将miR-99amimics导入宫颈癌Hela细胞,采用MTT法和平皿克隆形成实验观察miR-99a增加对Hela细胞增殖的影响;应用Tar-getscan 6.2软件预测miR-99a与HOXA1基因3'UTR的靶向性作用,荧光素酶报告基因分析miR-99a对HOXA1基因表达的影响,采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测miR-99a对HOXA1表达的作用;构建HOXA1干扰载体,转染Hela细胞,筛选后利用MTT法和平皿克隆实验观察HOXA1表达降低后对Hela细胞增殖的影响.结果 miR-99a被导入宫颈癌Hela细胞后,细胞的生长速度减慢,miR-99a mimics组Hela细胞克隆数为156±30,与miR-ctr组(386±49)比较,克隆数减少,F=26.093,P=0.001.采用Targetscan6.2 (http://www.targetscan.org/)软件分析miR-99a与HOXA1基因的作用位点发现,miR-99a与HOXA1基因3'UTR的1 485～1 497位核苷酸位点存在结合,miR-99a表达后,抑制Hela细胞中HOXA1的表达.干扰HOXA1表达后,Hela细胞生长速度减慢,平皿克隆形成能力降低,si-HOXA1克隆数为165±35,si-control克隆数为390±46,P＜0.05.结论 miR-99a与HOXA1基因3,UTR 1 485～1 497位核苷酸位点结合沉默其表达,抑制宫颈癌Hela细胞的增殖.
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miRNA-99a 对过氧化氢诱导 neuro-2a 细胞氧化损伤的影响
目的：研究 microRNA-99a(miR-99a)对过氧化氢所诱导神经细胞 neuro-2a 氧化损伤的影响。方法常规培养 neuro-2a细胞并分为3组：正常对照组,过氧化氢100μmol/ L 刺激组,miR-99a 预处理组(转染 miRNA-99a mimics+过氧化氢100μmol/ L刺激),用 CCK-8试剂盒检测细胞存活率,生化试剂盒检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)含量和总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)活性,Western blotting 检测突触小体相关蛋白(synaptosoma associated protein of molecular mass 25000,SNAP25)及 Mn-SOD、细胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)的蛋白表达水平。结果与正常对照组相比,过氧化氢刺激的2组细胞存活率明显下降,分别为85%和89%(P<0.05),但 miR-99a 预处理组的细胞存活率下降程度较小仅为11%(P<0.05)。进一步研究发现,过氧化氢刺激引起细胞 T-SOD、Mn-SOD 活性降低(P<0.05),转染 miR-99a mimics 不但能增强 T-SOD 和 Mn-SOD 的活性,还能促进 Mn-SOD 和 EC-SOD 的表达(P<0.05)。过氧化氢导致细胞中 NADH 含量降低(P<0.05),miR-99a 能够增加 NADH 含量甚至高于正常细胞水平(P<0.05)。 miR-99a 还有增加 neuro-2a 细胞表达 SNAP25的趋势。结论 miR-99a 对过氧化氢诱导neuro-2a 细胞引起的氧化损伤具有保护作用。
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和厚朴酚通过上调miR-99 a/b抑制HeLa细胞增殖和侵袭
目的 探究和厚朴酚对宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭的影响,并初步探讨相关分子机制.方法 将培养的对数期的人宫颈癌HeLa细胞分为对照组、Scramble组、miR-99a/b mimic组、和厚朴酚高、中、低剂量组.MTT实验用于检测不同干预对HeLa细胞增殖的影响,Transwell小室用于测定HeLa的侵袭能力,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)用于检测细胞中miR-99a、miR-99b的表达情况,蛋白免疫印迹(WB)检测细胞中cyclin D1、MMP7蛋白表达.结果 和厚朴酚高、中、低剂量组细胞增殖率和侵袭细胞数均明显低于对照组和DMSO溶剂组(P<0.05),并呈剂量依赖性.minic组和厚朴酚高、中、低剂量组miR-99a和miR-99b表达水平明显高于对照组和Scramble组(P<0.05);随着和厚朴酚剂量的增加,HeLa细胞中miR-99a和miR-99b表达水平逐渐升高.和厚朴酚高、中、低剂量组miR-99a和miR-99b表达水平明显高于对照组和Scramble组(P<0.05),且呈剂量依赖性.和厚朴酚高、中、低剂量组HeLa细胞增殖率和侵袭能力明显低于对照组和Scramble组,呈现剂量依赖性.Western blot法检测结果显示,minic组和和厚朴酚高、中、低剂量组cyclin D1和MMP7表达水平明显低于对照组和Scramble组(P<0.05);随着和厚朴酚剂量的增加,HeLa细胞中cyclin D1和MMP7表达水平明显降低.结论 和厚朴酚可能通过上调miR-99a/b表达,进而抑制宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭,为宫颈癌的靶向治疗提供一定的理论依据.
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miRNA－223,－99a 检测在儿童急性白血病中的临床应用
目的：探讨骨髓微小RNA（MicroRNA，miRNA）－223、－99a检测在儿童急性白血病（AL）中的临床应用。方法收集30例急性白血病患儿的骨髓染色及临床资料，分为复发组（ n ＝13）和缓解组（ n ＝17），另选取健康体检儿童8例作为对照组，采用实时荧光定量PCR（ Realtime－PCR，RT－PCR）技术检测儿童骨髓miR－223和 miR－99a的表达。比较分析以上两标志物在儿童急性白血病疾病中的变化。结果复发组和缓解组miR－223和miR－99a表达与对照组比较，差异均有统计学意义（ P ＜0．01）；复发组miR－223和miR－99a表达与缓解组比较差异有统计学意义（ P ＜0．01）。复发组和缓解组miR－223和 miR－99a表达呈负相关（r值分别为－0．529、－0．587， P ＜0．01）。结论骨髓miR－223和miR－99 a表达与儿童急性白血病的病变发展有关，其可作为儿童急性白血病诊断和治疗的分子标志物。
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miR-99a-mTOR在低氧调控人脐静脉内皮细胞增殖中的作用研究
目的 探讨低氧对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelia cell,HUVEC)增殖的影响及调控机制.方法 HUVEC在不同氧浓度(1％、5％、21％O2),37℃5％ CO2培养24 h,WST-1法检测增殖.生物信息学预测miR-99a靶基因并利用双荧光素酶报告基因检测方法验证.Lipofectamine 2000将miR-99a mimics、miR-99a siRNA、哺乳类动物雷帕霉素受体(mammalian target ofrapamycin,mTOR) siRNA、mTOR cDNA转染HUVEC,低氧下继续培养.qRT-PCR检测miR-99a表达,RT-PCR及Western blot检测mTOR表达.结果 与常氧(21％ O2)相比,低氧(1％O2)显著抑制HUVEC增殖(33.3％±6.5％,P=0.004).低氧上调miR-99a表达[(1.94±0.24)倍,P=0.001],进而抑制HUVEC增殖.生物信息学及荧光素酶报告基因系统检测显示mTOR为miR-99a靶基因,低氧时miTR-99a抑制mTOR基因及蛋白水平表达.进一步研究显示低氧通过miR-99a-mTOR途径抑制内皮细胞增殖.结论 低氧处理明显抑制HUVEC增殖,其机制可能与miR-99a-mTOR途径有关.
关键词： 低氧 miR-99a 哺乳类动物雷帕霉素受体 增殖 -
miR-99a对乳腺癌细胞侵袭和迁移的负向调控机制研究
目的 探讨miR-99a对乳腺癌细胞侵袭及迁移的影响,并初步分析其影响乳腺癌细胞侵袭及迁移的可能分子机制.方法 利用荧光实时定量PCR检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中miR-99a的表达.运用脂质体介导的转染方法分别将miR-99a模拟物(miR-99a mimics)、miR-99a抑制物(miR-99a inhibitors)以及相应对照miRNA转染MDA-MB-231和MCF-7细胞,通过Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭力;采用Transwell迁移实验及划痕实验检测细胞的迁移能力;利用生物信息学方法预测miR-99a的靶基因,并对靶基因进行验证.结果 (1)高转移潜能的MDA-MB-231细胞中miR-99a表达明显低于低转移潜能的MCF-7细胞,划痕实验中转染miR-99a mimics的与转染control mimics的MDA-MB-231细胞比较迁移能力显著减弱(P＜0.05),而MCF-7细胞转染miR-99a inhibitors后迁移能力明显增强(P＜0.01).(2)Transwell的侵袭及迁移实验显示,转染miR-99a mimics后MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力明显减弱(P＜0.01);MCF-7细胞转染miR-99a inhibitors后迁移能力增强(P＜0.01),而侵袭能力基本不变(P＞0.05).(3)生物信息学方法预测微管相关蛋白(MTMR3)是miR-99a的靶点,实时定量PCR和3'UTR荧光素酶报告基因实验验证了该靶点.(4)干扰了MTMR3后MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显减弱.结论 (1) miR-99a对乳腺癌细胞的侵袭及迁移发挥负向调控作用.(2)miR-99a可能通过靶向于MTMR3发挥其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的调控作用.
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mir-99a 的表达与上皮性卵巢癌患者预后的关系
目的：探讨 mir-99a 在上皮性卵巢癌（EOC）患者中的表达与临床病理特征及预后的关系。方法采用实时荧光定量 PCR （qRT-PCR）法检测137例 EOC 患者组织中 mir-99a 的表达水平，分析 mir-99a 表达与卵巢癌患者的临床病理资料的相关性。采用 Kaplan-Meier 法进行生存分析并绘制生存曲线，生存因素采用 log-rank 检验。结果EOC 患者组织中 mir-99a 的表达较癌旁正常组织降低（P ＜0．001）。mir-99a 的低表达与高组织学分级（P ＝0．027）、淋巴结转移（P ＝0．001）、腹膜转移（P ＜0．001）和较高的 FIGO 分期（P ＜0．001）有关。Kaplan-Meier分析与 log-rank 检验结果显示，mir-99a 的低表达与 EOC 患者生存期短有关（对数秩检验，P ＝0．005）。多因素分析结果显示，mir-99a 表达是患者总体生存的独立预测因子（HR 为2．368，95％CI：1．621，10．925，P ＝0．016）。结论mir-99a的表达是上皮性卵巢癌患者独立的预后因素，mir-99a 可能成为临床实践中一项新的诊断和预后标志物。
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LncRNA ANRIL靶向miR-99a的表达调控鼻咽癌细胞生物学行为的影响
目的 LncRNA ANRIL靶向miR-99a的表达调控鼻咽癌细胞生物学行为的影响及其机制.方法 qPCR检测ANRIL和miR-99a在鼻咽癌组织中的表达情况和ANTIL在不同鼻咽癌细胞株中的表达情况;分析ANRIL和鼻咽癌患者的临床病理资料之间的关联;双荧光素酶报告基因检测ANRIL与miR-99a之间的相互作用;MTT增殖实验和克隆形成实验检测抑制ANRIL后鼻咽癌细胞的增殖能力的变化情况,流式细胞术检测抑制ANRIL后对鼻咽癌细胞凋亡能力的变化情况;Western印迹检测抑制ANRIL后cyclinD1及E2F1等蛋白的表达情况;裸鼠体内成瘤实验检测抑制ANRIL后鼻咽癌细胞在裸鼠体内的成瘤情况.结果 与正常组织相比,ANRIL在鼻咽癌组织中的表达水平上调,与其他鼻咽癌细胞株相比,CNE1细胞中ANRIL表达高,miR-99a的表达水平高;ANRIL的表达与鼻咽癌的病理分期相关以及淋巴结转移情况有关,随着分期越高,ANRIL在鼻咽癌组织中表达越高,淋巴结转移的患者中ANRIL的表达也相对较高;双荧光素酶实验证实ANRIL能与miR-99a的3′UTR特异性结合,可以调控miR-99a的表达与活性;抑制ANRIL的表达后可以抑制鼻咽癌细胞的增殖能力,同时可以促进其凋亡能力;抑制ANRIL后,cyclinD1和E2F1蛋白的激活水平相应下调,抑制ANRIL后鼻咽癌细胞在裸鼠中的生长情况受到抑制.结论 ANRIL可以调控miR-99a的表达影响鼻咽癌细胞的增殖和迁移能力.
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miR-99a模拟物提高膀胱癌细胞化疗药物敏感性的机制研究
目的:研究miR-99a模拟物对膀胱癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响及相关分子机制.方法:培养膀胱癌BIU-87细胞株,随机分为对照组、吡柔比星组、miR-99a组、吡柔比星+miR-99a组,分别采用不含血清的培养基、1.0 μg/mL的吡柔比星、miR-99a的模拟物以及miR-99a的模拟物联合1.0 μg/mL的吡柔比星进行处理,处理后12、24、48 h时分别测定细胞活力以及PI3K、AKT、ABCE1、MRPS5的表达量.结果:吡柔比星组、miR-99a组、吡柔比星+miR-99a组的细胞活力值以及PI3K、AKT、ABCE1、MRPS5的表达量均显著低于对照组,吡柔比星+miR-99a组的细胞活力值以及PI3K、AKT、ABCE1、MRPS5的表达量均显著低于吡柔比星组和miR-99a组.结论:miR-99a模拟物能够通过靶向抑制PI3K/AKT信号通路及下游ABCE1、MRPS5基因表达的方式抑制膀胱癌细胞增殖、增加膀胱癌细胞对化疗药物的敏感性.
关键词： 膀胱癌 miR-99a 吡柔比星 磷脂酰肌醇3激酶 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 -
腺病毒介导miR-99a过表达抑制人结肠癌HCT-8细胞的生长抑制及其作用机制
目的 探讨miR-99a过表达对人结肠癌HCT-8细胞的生长抑制及其作用机制.方法 构建miR-99a的重组腺病毒Ad5-miR-99a,并感染人结肠癌HCT-8细胞.采用甲基化特异性PCR检测miR-99a、抑癌基因SOCS1和P16的甲基化水平;采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测miR-99a、DNAC5胞嘧啶甲基转移酶、SOCS1和P16的表达情况;采用MTT法、细胞集落形成和流式细胞术检测HCT-8细胞的体外增殖凋亡情况;采用裸鼠体内荷瘤实验检测HCT-8细胞体内成瘤性.结果 成功构建miR-99a腺病毒载体Ad5-miR-99a.Ad5-miR-99a感染HCT-8细胞后,Ad5-miR-99a组细胞中miR-99a表达显著高于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05),而其甲基化水平显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05);Ad5-miR-99a组细胞中DNAC5胞嘧啶甲基转移酶表达显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05);Ad5-miR-99a组细胞中SOCS1和P16表达显著高于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05),而其甲基化水平显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05).MTT法、细胞集落形成、流式细胞术和裸鼠体内荷瘤实验显示,Ad5-miR-99a组细胞的体外增殖和体内成瘤能力显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P＜0.05).结论 miR-99a可显著抑制人结肠癌HCT-8细胞的体外增殖和体内成瘤能力,其机制可能与miR-99a过表达导致DNMTl表达升高,降低抑癌基因SOCS-1和P16甲基化程度,使得SOCS-1和P16高表达,从而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用.
