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环介导等温扩增技术及其在传染性疾病检测中的应用
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是近年来发展起来的新型恒温核酸扩增技术,与传统的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)相比具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,已被广泛应用于传染性疾病的检测.本文就LAMP技术的原理、特点及其在常见传染性疾病检测中的应用进行综述.
关键词： 环介导等温扩增(LAMP) 传染性疾病 检测 -
环介导等温扩增技术的常见问题分析与研究进展
环介导等温扩增(LAMP)技术是近年发展起来的新型核酸体外等温扩增技术,具有快速、特异、敏感、简便等特点,使该技术在核酸快速检测领域得到了广泛的应用,但LAMP技术也在不断完善与发展中.本文就LAMP扩增产物的污染,引物间非连续配对的假阳性问题的对策,以及在LAMP技术基础上发展起来的其他相关技术进行综述,为该技术在基层的推广应用提供参考.
关键词： 环介导等温扩增(LAMP) 非特异性 敏感性 -
环介导等温扩增技术检测新兵腺病毒感染研究
目的 建立环介导等温扩增(LAMP)方法,用于腺病毒7、14和55型感染检测. 方法 针对腺病毒7、14和55型Hexon区段设计4条特异性引物,建立LAMP预反应体系.然后对反应温度和时间进行优化;通过与PCR比较评估该方法的特异性和灵敏度,同时观察使用钙黄绿素染料的检测效果,后对40例新兵鼻咽分泌物标本进行检测.结果 优化的LAMP适扩增温度为65℃,扩增时间为60 min.建立的LAMP方法特异性好,只有腺病毒7、14和55型扩增阳性.LAMP可以使1∶1 000倍稀释的腺病毒DNA得到扩增,其灵敏度比PCR高10倍.同时用LAMP和PCR法对新兵腺病毒感染情况用SPSS软件进行比较,结果LAMP法与PCR法的一致性较差(Kappa=0.562,P＜0.05),而与荧光定量PCR(FQ-PCR)一致性较高(Kappa=0.818,P＞0.05).利用染料钙黄绿素进行可视化检测的效果和电泳方法相当. 结论 LAMP法检测腺病毒7、14和55型感染优于PCR法,这种新方法也适用于基层医院实验室和流行区.
关键词： 腺病毒 环介导等温扩增(LAMP) 新兵 -
2型猪链球菌89K毒力岛Ⅳ型分泌系统LAMP检测方法的建立
目的 建立针对高致病性2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,SS2)89K毒力岛Ⅳ型分泌系统的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法. 方法 根据国内流行株特有89K毒力岛编码的Ⅳ型分泌系统(T4SS-89K)的virB4 89K基因保守区域设计并合成LAMP引物,通过优化反应体系和扩增条件建立T4SS-89K快速检测方法,对方法的特异性、敏感性进行评估. 结果 优化的LAMP反应体系具有良好的扩增效率,检测灵敏度为1.53×101拷贝/反应,全部扩增检测可在60 min内完成;建立的LAMP法具有良好的特异性,与不含T4SS-89K的猪链球菌(包括1/2型、1型、3～33型),以及其他常见9种对照菌均不发生特异性扩增,而与1998和2005年疫情现场分离的高致病性SS2均可发生特异性扩增. 结论 建立的LAMP方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,可用于高致病性SS2快速检测.
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小反刍兽疫病毒环介导等温扩增检测方法的建立
目的 建立快速、简便和特异的小反刍兽疫病毒(PPRV)分子生物学诊断方法. 方法 针对PPRV N基因保守区设计2对特异性引物和1套环引物,对反应体系中的Mg2+、Betaine、Bst DNA Polymerase、dNTP、环引物和反应温度等条件分别进行优化,建立用于检测PPRV的环介导等温扩增方法(LAMP). 结果 建立的LAMP方法检测PPRV时,在62 ℃水浴锅中反应30 min即可直接观察结果.该方法具有高度特异性,可检测到1.6个TCID50 PPRV.结论建立的PPRV LAMP检测方法具有特异、快速、简便等优点,为小反刍兽疫病提供了一种新的诊断方法.
关键词： 小反刍兽疫病毒 环介导等温扩增(LAMP) 检测 -
大肠埃希菌O157∶H7环介导等温扩增可视化检测方法的建立
目的 建立肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导等温扩增(LAMP)可视化快速检测方法. 方法 针对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7编码脂多糖rfbE基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据HNB的颜色变化进行结果判定,评价LAMP方法的特异性和灵敏性. 结果 建立的LAMP法对O157∶H7 rfbE基因的低检出限约为100 copy/反应管,检测肠产毒性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、宋内志贺菌、福氏志贺菌均为阴性.体系的扩增效率较高,可在40 min内出结果. 结论 建立的基于颜色判定的EHEC O157∶H7 LAMP检测方法具有特异、灵敏,设备要求简单等特点,适用于EHEC O157∶H7的快速检测.
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新型布尼亚病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立
目的 应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立新型布尼亚病毒(SFTSV)可视化快速检测方法. 方法 针对新型布尼亚病毒的S片段基因设计LAMP引物建立LAMP方法.反应体系内加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应扩增指示剂,根据LAMP浊度仪扩增结果优化反应条件,根据HNB颜色变化进行结果判定,评估LAMP方法的特异性和灵敏性. 结果 建立的LAMP方法低检出限为10拷贝/反应管;方法的特异性高,仅SFTSV反应管颜色由紫罗兰变为天蓝色,而汉坦病毒、新疆出血热、Q热、马尔堡、埃博拉病毒及阴性对照反应管均未发生变色反应;LAMP反应的佳温度为63 ℃,其扩增效率高于常规PCR,试验过程仅需30 min. 结论 建立的可视化SFTSV LAMP检测方法具有特异性强,灵敏性高,实验设备要求简单等优点,可用于SFTSV的快速检测.
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环介导等温扩增技术在临床检测中的优势与展望
环介导等温扩增技术(LAMP)因其在众多核酸扩增技术中具有灵敏、特异、操作简单等优势,被众多研究者用来扩增各种病原体.本文综述了LAMP技术在临床检测方面的显著优势、几点不足和相应建议,后对该技术的未来发展进行展望,旨在为该技术在疫区现场和基层医疗机构的推广应用进一步扩宽研究思路.
关键词： 环介导等温扩增(LAMP) 核酸扩增 快速检测 -
应用环介导等温扩增法快速检测食品中沙门氏菌的研究
目的 建立快速、准确检测食品中沙门氏菌基因的方法. 方法 针对沙门氏菌高侵袭性位点A(hyper invasive locus A,invA)基因设计4条LAMP引物.提取沙门氏菌基因组DNA,与LAMP反应液及显色液混匀后进行扩增反应,1h内通过颜色变化观察结果.将细菌DNA 10倍系列稀释后分别进行LAMP及PCR反应,评价LAMP法的敏感性.对50份已知食物样品进行检测,评价LAMP法的特异性. 结果 LAMP法可在40 min内检出沙门氏菌.其敏感性为0.05 ng/ml DNA,是PCR方法(0.5 ng/ml DNA)的10倍,特异性与PCR方法相当;LAMP法检测食品中沙门氏菌的符合率为98％,PCR法为90％. 结论 采用建立的LAMP法检测食物样品中的沙门氏菌快速、准确、操作简单,无需要特殊仪器,适合基层相关部门应用.
关键词： 沙门氏菌 食品 环介导等温扩增(LAMP) 快速检测 -
霍乱弧菌毒力基因LAMP方法快速检测
目的 建立快速、特异检测霍乱弧菌的环介导等温扩增(LAMP)方法.方法 针对霍乱弧菌毒素基因(ctxA)设计4条引物,建立环介导等温扩增检测方法,优化反应体系,测定方法的特异性和灵敏度,并进行鱼肉模拟样品和实际样品检测.结果 LAMP佳反应条件为8.0 mmol/L Mg2+、0.6 mmol/L dNTPs、1.6μmol/L FIP和BIP(2条内引物)、0.2μmol/L F3和B3(2条外引物);对细菌纯培养物的检测灵敏度为10 cfu/mL,对鱼肉模拟样品检测灵敏度为102 cfu/g;在16份实际样品中检测出4份ctxA基因阳性.结论 建立的LAMP方法灵敏度高、特异性强,可快速地检测食品样品中霍乱弧菌.
关键词： 环介导等温扩增(LAMP) 霍乱弧菌 ctxA基因 -
环介导等温扩增(LAMP)试剂盒检测石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)
目的 建立一种检测石蜡包埋的肝组织中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的新方法,并探讨其应用价值和临床意义.方法 提取30例慢性HBV感染患者的石蜡包埋肝组织中的DNA,采用质粒安全ATP依赖性DNA酶(plasmid-safe ATP-dependent DNase,PSAD)消化,去除非cccDNA后,加入引物及Bst DNA酶进行环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),将检测结果与临床实验室资料结合并进行分析,以判断其临床应用价值.结果 30例HBV感染患者中,有17例HBV cccDNA阳性,阳性检测率56.67％.其中肝癌5例、肝硬化4例、重型乙型肝炎5例、慢性乙型肝炎(轻-中度)3例.提示肝组织HBV cccDNA阳性可能与疾病进展密切相关,与血清HBVcccDNA阳性有一定的相关性,与乙型肝炎病毒血清免疫标志物以及肝功能状况无明显相关.结论 LAMP法能检测到石蜡包埋肝组织中的HBV cccDNA,结合临床实验室资料,对判断抗病毒药物疗效及研究乙型肝炎致病机制具有一定的意义.
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LAMP快速检测沙门菌invA基因的方法建立与应用
目的:建立一种环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)反应快速检测沙门菌的方法.方法:根据美国国立卫生研究院基因序列数据库(GenBank)上的鼠伤寒沙门菌的特异invA和fimA(登录号:M90846和M18283)基因序列,设计特异引物,提取标本DNA,然后以LAMP技术扩增invA基因,PCR方法扩增fimA基因,采用琼脂糖电泳观察结果.结果:91份血培养阳性报警瓶,LAMP和PCR法检测出阳性18份,与终培养结果一致;30份粪便标本,LAMP和PCR法检测出阳性5份,培养阳性3份,LAMP测限达到102CFU/mL.结论:LAMP是一种简便、快速、特异和敏感的检测临床和环境标本中沙门菌的有效方法.
关键词： 沙门菌 环介导等温扩增(LAMP) 核 酸 -
LAMP法检测儿童粪便中肠道腺病毒的建立
目的 通过应用环介导等温扩增(LAMP)建立一种快速、简便的可视化检测儿童肠道腺病毒核酸的方法.方法 登录GenBank网站下载腺病毒40和41基因型的六邻体序列,根据该区段的保守序列设计4条LAMP引物.将反应体系加入EP管,在恒温条件(65℃)扩增60 min后,再以凝胶电泳和钙黄绿素染色评价LAMP法的特异性和灵敏度,并和PCR法的结果相比较.后,同时用LAMP和PCR法对40份可疑临床样本进行检测,应用卡方检验进行统计学分析.结果 LAMP法能准确地使腺病毒40和41型得到扩增,酶切结果也正确,显示了LAMP法较好的特异性.LAMP的灵敏度比PCR高约10倍.经过对40份临床样本的检测,LAMP与PCR均没有发生非特异扩增,LAMP法和PCR法的一致性为92.5％(P＞0.05)且LAMP法没有漏检阳性样本.另外,使用钙黄绿素染色的方法更好地显示了产物检测的可视性和简便性.结论 该研究初步建立了快速、简便、可视化检测肠道腺病毒的LAMP技术,在基层医疗机构有一定的实用价值.
关键词： 肠道腺病毒 环介导等温扩增(LAMP) 儿童 -
肺孢子菌感染或定植与呼吸系统疾病的相关性探讨
目的 检测呼吸疾病患者肺内肺孢子菌基因阳性率,探讨肺孢子菌定植或感染的影响因素及其与呼吸系统疾病的相关性.方法 设计3对特异性引物,构建检测肺孢子菌16S rRNA基因的LAMP反应体系.通过对大鼠感染模型的肺孢子菌基因检测,验证其敏感性和特异性;通过对临床呼吸疾病患者痰液样本肺孢子菌基因的检测,分析肺孢子菌感染或定殖与呼吸系统疾病的相关性及其影响因素.结果 本研究建立的LAMP方法检测肺孢子菌16S rRNA基因的低检测极限为50 copies/mL;与念珠菌等8种呼吸道病原体不发生交叉反应.共收集和检测98例呼吸疾病患者痰标本,肺孢子菌基因总检出率为63.3％(62/98).合并呼吸道感染者63例,非合并感染者35例,肺孢子菌基因阳性率分别为60.3％和75.0％,x2检验两者差异有统计学意义.肺部影像学有改变者肺孢子菌基因检出率为72.5％,肺部影像学无改变者检出率为53.19％,x2检验两者具有显著性差异.COPD和非COPD患者肺孢子菌基因检出率分别为53.2％和71.2％,x2检验两者无显著性差异;COPD急性发作期和稳定期阳性率分别为66.8％和46.9％,x2检验两者差异无统计学意义.CD4+T淋巴细胞数降低患者肺孢子菌基因检出率80.0％;CD4+T淋巴细胞数正常者的检出率为60.27％,x2检验两者差异具有统计学意义.1,3-β-D-葡聚糖血含量升高和含量正常患者的肺孢子菌基因检测结果显示,x2检验两者差异无统计学意义.结论 呼吸疾病患者中肺孢子菌基因检出率较高.两者是否有直接的因果关系尚需进一步研究.合并其他细菌感染者肺孢子菌基因阳性率较低,其机制有待于进一步研究.CD4+T细胞数降低者肺孢子菌基因阳性率升高,符合肺孢子菌为机会感染的特点.
关键词： 环介导等温扩增(LAMP) 肺孢子菌 基因检测 呼吸系统疾病 -
环介导等温扩增技术在致病菌检测中的应用
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是近10年来发展起来的具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点的新的恒温核酸扩增技术,已被应用于致病菌检测的研究.LAMP技术需针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物,并采用链置换型DNA聚合酶,操作步骤少,不需要聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术复杂的设备.本文就LAMP技术在致病菌检测中的应用作一综述.
关键词： 环介导等温扩增(LAMP) 致病菌 检测 -
海产品中副溶血弧菌三种快速检测方法的比较研究
目的 比较三种方法快速测定海产品中副溶血弧菌的专属性和灵敏度.方法 选取荧光定量PCR、LAMP、显色培养基法分别对阳性对照菌和阴性对照菌共13株进行特异性、灵敏度试验,并对结果进行比较分析.结果 PCR、LAMP法检测副溶血弧菌与显色培养基法相比具有更好的专属性；LAMP法的灵敏度高,菌液浓度为10 cfu/ml时即可检出；PCR法次之,为800 cfu/ml；显色培养基法低,为6500 cfu/ml.结论 三种副溶血弧菌快速检测方法中,PCR、LAMP法具有更好的专属性；LAMP法的灵敏度高,PCR法次之,显色培养基法低.
关键词： 副溶血弧菌 荧光定量PCR 环介导等温扩增(LAMP) 快速检测 -
SARS冠状病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立
目的 应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立SARS冠状病毒可视化快速检测方法.方法 针对SARS冠状病毒RNA聚合酶编码基因保守区设计LAMP引物及环引物,反应体系加入钙黄绿素作为LAMP扩增反应指示剂,结合LAMP浊度仪优化扩增条件,根据钙黄绿素的颜色变化进行结果判定,评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性.结果 本方法低检出限约为10拷贝/反应管,高于普通PCR;检测特异性高,仅SARS冠状病毒反应管钙黄绿素颜色由褐色变为黄绿色,而甲型H1N1病毒、高致病性H5亚型禽流感病毒、普通流感病毒均不发生变色反应；体系的扩增效率高于普通PCR,35 min内出结果.结论 所建立的基于颜色判定的SARS病毒检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于SARS冠状病毒现场快速检测.
关键词： SARS病毒 可视化检测 环介导等温扩增(LAMP) 钙黄绿素 -
环介导等温扩增技术的应用
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温65℃左右保温几十分钟快速进行核酸扩增的方法.由于其具有快速、简便、特异性好、灵敏度高、成本低等优点,已经应用丁临床诊断、食品卫生检疫及基因芯片的开发,特别足在细菌和病毒的检测方面有重要意义.
关键词： 环介导等温扩增(LAMP)
