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刚地弓形虫尿苷磷酸化酶的克隆、表达与免疫反应性检测
目的 预测刚地弓形虫尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase,TgUPase)基因编码蛋白的主要特性和抗原表位,克隆、表达TgUPase基因,并检测其免疫反应性. 方法 采用生物信息学在线分析程序和软件预测TgU-Pase蛋白的理化性质和抗原表位.提取RH株弓形虫速殖子总RNA.根据TgUPase基因全长编码序列(GenBank登录号为DQ385446.1)的开放阅读框设计引物,并用RT-PCR扩增,扩增产物经双酶切后连接人pET-30a(+)载体.用重组质粒转化大肠埃希菌(E coli) DH5αt,阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定.将重组质粒pET-30a (+)-TgUPase转化至E coli BL21(DE3),并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,分别以抗His标签抗体和人抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白及其免疫反应性. 结果 生物信息学预测结果显示,TgUPase蛋白由303个氨基酸组成,相对分子质量(Mr)为33 042.9,为可溶性蛋白,有3个潜在的T/B细胞联合抗原表位.RT-PCR扩增产物约为921 bp.菌落PCR、双酶切以及测序结果表明,重组质粒pET-30a (+)-TgUPase构建成功.SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导获得约Mr 38000的可溶性重组蛋白(带His标签).Western blotting结果显示,重组蛋白能被His标签抗体和人抗弓形虫血清识别.结论 成功构建了重组质粒pET-30a(+)-TgUPase,获得刚地弓形虫重组尿苷磷酸化酶,且重组蛋白具有免疫反应性.
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脊椎动物和寄生虫尿苷磷酸化酶的研究进展
尿苷磷酸化酶(uridine phosphorylase,UPP)是嘧啶补救合成途径的一种关键性调节酶,可逆地催化尿嘧啶核苷、脱氧尿嘧啶核苷转变为尿嘧啶和核糖-1-磷酸,对维持和调控组织中尿嘧啶核苷的浓度起着至关重要的作用.不同物种的尿苷磷酸化酶虽然在功能上有很多相似之处,但是在理化性质、结构特点、活化位点、与底物结合位点等诸多方面存在差异,因此将尿苷磷酸化酶作为靶点,设计和开发抗菌、抗寄生虫感染药物有着广阔的前景.本文综述不同生物来源的尿苷磷酸化酶蛋白的理化性质及研究进展,为研究刚地弓形虫UPP基因表达蛋白作为抗弓形虫疫苗靶点的可行性提供理论依据.
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尿嘧啶核苷磷酸化酶基因在胃癌、肺癌和结肠癌组织中的表达水平及其临床意义
目的分析尿嘧啶核苷磷酸化酶基因的表达水平与胃癌、肺癌和结肠癌临床病理因素之间的关系.方法采用RT-PCR法检测了28例胃癌,12例肺癌和20例结肠癌组织中尿嘧啶核苷磷酸化酶基因(UPase)的表达.结果与正常组织相比,UPase基因在胃癌组织中的表达水平增高,而在肺癌和结肠癌组织中的表达无明显差异.胃癌组织中UPase基因表达增高患者的生存率较表达正常或降低患者的生存率稍高,但无统计学意义(P＞0.05);肺癌和结肠癌组织中UPase基因表达增高患者的生存率与表达降低患者的生存率相比无明显差异(P＞0.05).UPase基因表达水平与胃癌、肺癌和结肠癌的临床期别、病理分级、淋巴结转移无相关性.结论UPase基因在胃癌、肺癌、结肠癌中表达水平不同,在胃癌组织中呈高表达状态,其高表达可能与胃癌患者的高生存率有关.
