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日本血吸虫两种酪氨酸酶的克隆、表达和转录特异性分析
目的 克隆、表达日本血吸虫2种酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的全长基因,并研究这2种基因在日本血吸虫不同性别和不同发育阶段的转录特异性. 方法 设计特异性引物,从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出SjTYR1和SjTYR2的全长片段,并克隆入原核表达载体pSJ2,验证正确的重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)Rosetta Gami细胞,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并用组氨酸标签对表达产物进行亲和层析纯化.将纯化后获得的重组蛋白SjTYR1和SjTYR2分别免疫新西兰白兔制备免疫兔血清.分别以重组蛋白免疫兔血清和日本血吸虫感染兔血清为一抗,用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性和免疫反应性;以重组蛋白免疫兔血清为一抗,用Western blotting观察其与日本血吸虫虫体蛋白的反应情况.制备感染后14、16、18、20、22、24、26和28 d雌虫和雄虫的总RNA,利用RT-PCR分析SjTYR1和SjTYR2基因在日本血吸虫不同性别及不同发育时间的转录水平的差异. 结果 构建了重组原核表达载体SjTYR1/pSJ2和SjTYR2/pSJ2,诱导后获得包涵体形式表达的重组蛋白,相对分子质量(Mr)分别为55 000和56 800,与预测的融合蛋白相对分子质量相符.纯化后的重组蛋白SjTYR1可被日本血吸虫感染兔血清识别,而SjTYR2则不能.rSjTYR1免疫兔血清与虫体蛋白反应后,可见一条约Mr 100 000的条带,rSjTYR2免疫兔血清不与虫体蛋白反应.在雄虫体内,2种酪氨酸酶均不转录;在雌虫体内,2种酪氨酸酶在感染后24 d内不转录,自24d开始出现激增,之后逐渐提高,感染后28 d达到相对大值. 结论 构建了SjTY R1和SjTYR2的重组质粒并表达,2种重组蛋白均具有免疫原性和免疫反应性.SjTYR1和SjTYR2在血吸虫雌虫中特异表达,且在感染终宿主后24～28 d转录水平升高.
