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人P选择素lectin基因片段的克隆及表达
应用PGR技术扩增P选择素lectin基因,克隆入pET42b(+)载体,测序验证后在大肠杆菌BL21中表达了lectin C端融合6×His蛋白,表达产物经Ni2+-NTAsupeflow亲和柱纯化,纯度可达90%以上,得率为0.9 mg/100ml,其表达量达到总菌体蛋白的15%.SDS-PAGE和Western印迹试验显示,表达产物相对分子质量为13 000.
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P-选择素研究进展
P-选择素是相对分子质量为140 000的糖蛋白,存在于血管内皮细胞的Weibel-Palade小体膜上及血小板α颗粒膜上,在受到组织胺、凝血酶、佛波酯和钙离子载体A23187的刺激后,其迅速在质膜上表达,缺氧/再氧化或氧自由基也可诱导表达.P-选择素凝集素样区是配体结合部位的关键序列,其配体是唾液酸化路易斯(S-Lewisx),高亲和力的配体是P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand 1,PSGL-1),主要表达于中性粒细胞和单核细胞,因此P-选择素主要介导粒细胞和单核细胞在内皮细胞表面的滚动、粒细胞和单核细胞与血小板的黏附.
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P选择素凝集素样区和表皮生长因子样区的原核表达质粒构建
P选择素(P-selectin)作为血小板/内皮细胞活化分子及粘附受体,在早期炎症、血栓形成、肿瘤转移等发挥重要作用[1-5],已成为近年研究热点.然而有关P选择素分子表位结构与其功能关系研究将有助于进一步阐明P选择素生理、病理意义及其参与疾病发病机制的作用,进而为针对其临床特异性抗粘附治疗奠定基础.为此我们采用基因工程技术,成功地构建了P选择素分子表位片段,为制备上述表位特异性单克隆抗体,进一步探讨P选择素表位结构与其功能关系提供基础.