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HPC2突变体真核表达载体的构建
目的 构建在哺乳动物细胞表达的HPC2真核表达突变载体,并在U2OS细胞中表达.方法 从人U2OS细胞中克隆HPC2cDNA片段,并利用Gateway技术构建pcDNA3.2/V5/HPC2质粒.将质粒用脂质体瞬时转染U2OS细胞,细胞裂解后用Western blot分析HPC2的表达情况.设计突变引物,以HPC2质粒为模板进行PCR,将PCR产物连接并转化扩增,得到特定位点突变的pcDNA HPC2质粒.结果 PCR、酶切、测序均表明pcDNA-V5/HPC2突变质粒构建成功,并可在U2OS细胞中表达.结论 成功构建了pcDNA-V5/HPC2突变真核表达载体,为研究HPC2的功能提供了有力的工具.
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lncRNA HIT对骨肉瘤组织和细胞U2OS顺铂抵抗的影响及其机制
目的:探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HIT与骨肉瘤细胞顺铂(cisplatin,DDP)抵抗的关系及其上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的相关机制.方法:选择天津医院骨科2017年6月至2018年6月42例骨肉瘤组织及相应癌旁组织(距癌变边缘＞5 cm)标本,采用qRT-qPCR检测骨肉瘤组织及相应癌旁组织中HIT及EMT标志物Snail、E-钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA的表达水平.构建DDP抵抗的入骨肉瘤U2OS细胞株及人肾上腺293T细胞株作为抵抗组及对照组,采用慢病毒转染两组表达靶向HIT的siRNA载体于抵抗组细胞中作为干扰A组及B组,同时转染HIT过表达载体及空白载体构建HIT过表达的U2OS细胞株及空白U2OS细胞株分别作为过表达组及空白组.MTT实验检测各组细胞DDP半抑制浓度(IC50),qRT-PCR实验检测各组细胞中HIT、Snail及E-cadherin mRNA的表达水平,Westem blotting检测各组细胞Snail及E-cadherin的表达水平,RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-IP)实验检测U2OS及293T细胞中HIT与Snail蛋白分子的结合情况.结果:骨肉瘤组织中HIT及Snail mRNA表达显著高于癌旁组织、E-cadherin mRNA表达显著低于癌旁组织,且骨肉瘤组织中HIT与E-cadherin mRNA表达呈显著负相关(均P＜0.01);抵抗组细胞DDP IC50显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,过表达组DDP IC50显著高于空白组(均P＜0.01);抵抗组细胞HIT表达显著高于对照组,干扰A组及B组细胞HIT表达显著低于抵抗组及对照组,过表达组HIT表达显著高于空白组(均P＜0.05或P＜0.01);抵抗组细胞Snail、E-cadherin mRNA表达水平显著高于或低于对照组、干扰A组及干扰B组,过表达组E-cadherin mRNA显著低于空白组;抵抗组细胞Snail蛋白表达水平显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,E-cadherin蛋白表达水平则显著低于对照组、干扰A组及B组细胞,过表达组Snail蛋白表达水平显著高于空白组(P＜0.05或P＜0.01);在U2OS及293T细胞中,免疫磁珠介导Anti-snail抗体下拉HIT的表达水平显著高于对照IgG抗体下拉HIT的表达水平(P＜0.0l).结论:HIT通过正调控Snail蛋白水平,抑制E-cadherin的转录活性,从而促进骨肉瘤细胞EMT及DDP抵抗的发生.
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miR-645对骨肉瘤U2OS细胞生物学功能的影响
目的：构建hsa-miR-645 inhibitor真核表达载体，观察miR-645在人骨肉瘤U2OS细胞中的表达及对细胞增殖、侵袭和对靶基因TNFR2表达的影响，并初步分析miR-645影响骨肉瘤细胞的可能机制。方法将hsa-miRNA-645 inhibitor基因克隆到真核表达载体pEZX AM02-U6 pur中，构建成pEZX AM02645 inhibitor重组表达载体，将表达载体瞬时转染骨肉瘤U2OS细胞，RT-PCR法检测miR-645在转录水平的表达，MTT法检测细胞的增殖情况，Transwell法检测细胞的侵袭情况，生物信息学的方法预测miR-645的靶基因，并进行基因功能初步分析，化学发光法检测细胞中TNFR2表达的情况。结果真核表达载体pEZX AM02645 inhibitor成功转染U2OS细胞，并经RT-PCR检测可有效表达，MTT法结果显示hsa-miR-645 inhibitor能明显抑制细胞增殖， Transwell法结果显示hsa-miR-645 inhibitor能降低细胞侵袭能力，报告基因检测结果显示TNFR2为miR-645在U2OS细胞中的作用靶点之一。结论构建了真核表达载体pEZX AM02645 inhibitor，转染骨肉瘤U2OS细胞后能有效表达，并以TNFR2基因作为作用靶点。
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三氧化二砷联合小白菊内酯诱导人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究
目的 研究三氧化二砷与小白菊内酯联合应用于人骨肉瘤细胞U2OS,对其增殖产生的抑制作用.方法 培养人骨肉瘤细胞株U2OS作为研究对象,选取不同药物浓度的三氧化二砷及小白菊内酯分别以单独和联合应用的形式作用于骨肉瘤细胞后,通过倒置显微镜观察其细胞学形态的变化,应用MTS方法分析药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用.结果 三氧化二砷和小白菊内酯联合用药对人骨肉瘤细胞U2OS具有生长抑制作用,并优于三氧化二砷或小白菊内酯单独用药,而且小白菊内酯及三氧化二砷对U2OS细胞抑制作用具有时间和浓度依赖性.结论 三氧化二砷和小白菊内酯联合用药诱导人骨肉瘤细胞U2OS的凋亡,起到了良好的抗肿瘤作用.
