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缺锌对增殖期大鼠生长板软骨细胞凋亡的影响
目的 探讨锌缺乏对增殖期大鼠肋生长板软骨细胞(RGC)凋亡的影响,为阐明锌对骨骼生长发育影响的机制提供科学依据.方法 体外培养Wistar大鼠RGC,用0,5,10及20μmol/L的锌螯合剂N-N-N′-N′-4(2-吡啶甲基)乙二胺(TPEN)分别处理细胞12 h.采用流式双染试剂盒研究早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比.以5μmol/L TPEN作用6,12,24 h,利用免疫组化技术检测细胞中凋亡诱导因子(AIF)的定位表达,并利用Western blot和实时定量PCR(real-time PCR)检测其表达水平的变化.结果 随着TPEN浓度的增高,RGC细胞凋亡率也逐渐增加,各组早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比增大,AIF的表达水平也逐渐升高.免疫组化染色结果显示在TPEN作用6 h后,AIF已从线粒体迁出,12 h及24 h后,大部分AIF已从线粒体迁至细胞核.结论 锌缺乏可以诱导RGC细胞凋亡,在凋亡的过程中AIF发挥着关键作用.
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锌对大鼠生长板软骨细胞ZnT-7表达的影响
目的 研究锌对大鼠生长板软骨细胞锌转移体-7(ZnT-7)表达的影响及其规律.方法 原代培养Wistar大鼠肋生长板软骨细胞,不同浓度的锌螯合剂TPEN分别处理培养生长板软骨细胞12 h.免疫组化检测生长板软骨细胞特异性Ⅱ型胶原表达.免疫荧光技术对ZnT-7进行定位研究,实时RT-PCR和Western blot检测znT-7表达.结果 Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性.ZnT-7在生长板软骨细胞中定位于高尔基体上;Western blot和RT-PCR结果显示;5 μmol/L(TPEN)组与对照组相比略有增高,而10 μmol/L、20 μmol/L组与对照组相比逐渐降低.结论 ZnT-7定位于高尔基体上,同时在缺锌的条件下其对锌离子稳定有一定的代偿作用.
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染料木黄酮对生长板软骨细胞胶原合成的影响及其机制
目的 探讨染料木黄酮(5,7,4'-三羟基异黄酮)对大鼠肋生长板软骨细胞(rat costo-chondral growth plate chondrocyte,RGC)胶原和Sox9表达的影响.方法 原代培养RGC,3H-proline参入、RT-PCR和Western blot分别检测染料木黄酮对第1代RGC胶原合成、col2a1基因转录和Sox9表达的影响.结果 染料木黄酮抑制RGC的胶原合成(P＜0.05),col2a1的转录和Sox9的表达,其抑制作用随着浓度的升高而增强.结论 染料木黄酮抑制培养RGC胶原合成的作用至少部分是通过下调Sox9的表达实现的.
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一氧化氮在兔生长板软骨细胞终末分化中的生物学作用
原代分离及培养兔肋软骨生长板软骨细胞,添加不同浓度的全反式维甲酸(AT-RA)诱导软骨细胞的终末分化.酶动力学法检测碱性磷酸酶(AKP)及细胞培养上清液中一氧化氮合酶(NOS)活性;硝酸还原酶法检测所培养软骨细胞上清液中一氧化氮(NO)浓度;AT-RA分别联合NOS抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)及可以产生NO的S-亚硝基谷胱甘肽(SNOG)作用于原代培养的生长板软骨细胞,分别检测AKP活性.结果发现随着AT-RA浓度的递增,AKP、NOS活性及NO浓度明显增加(P＜0.05); L-NAME明显抑制所培养的生长板软骨细胞AKP的活性(P＜0.05),SNOG可以提高所培养的生长板软骨细胞AKP的活性(P＜0.05).认为NO可以促进兔肋软骨生长板软骨细胞的终末分化.
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生长板软骨细胞促进骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达
目的观察骨髓基质干细胞(BMSCs)在生长板软骨细胞旁分泌作用下血管内皮生长因子(VEGF)的表达规律及其与成骨分化的相关性.方法大鼠BMSCs与生长板软骨细胞进行间接共培养,培养终末期做细胞化学染色,定量测定碱性磷酸酶(ALP)活性,用RT-PCR方法半定量检测VEGF mRNA的表达.结果生长板软骨细胞持续高表达VEGF.BMSCs随共培养时间的延长,ALP活性升高,BMSCs的VEGF的表达也逐渐增强.培养液加入两种分泌型VEGF中和抗体后,VEGF表达趋势不变,ALP活性仍为升高趋势,也不影响培养终末期钙化结节的形成.培养终末期BMSCs的CD31和CD34均阴性.结论BMSCs成骨分化过程中VEGF的表达符合成骨细胞分化基因的表达规律,与成骨细胞特征性基因的表达趋势一致,体外条件共培养条件下,中和VEGF后并不能阻碍BMSCs的成骨分化.
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腺病毒介导ERK-2基因在生长板软骨细胞中的表达
目的:构建ERK-2基因重组腺病毒载体,检测构建的腺病毒感染原代大鼠生长板软骨细胞的效率以及目的基因的表达.方法:将ERK-2 cDNA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转染E.Coli.BJ5183,将筛选、鉴定的重组腺病毒质粒线性化后转染HEK293细胞进行病毒颗粒的包装;流式细胞术检测不同感染复数(MOI)ERK-2重组腺病毒感染原代培养的大鼠肋生长板软骨细胞的效率,Western blot检测腺病毒感染的生长板软骨细胞中ERK-2蛋白的表达.结果:成功构建ERK-2重组腺病毒,MOI 50的腺病毒感染原代生长板软骨细胞的效率大于90%,感染的生长板软骨细胞中ERK-2表达显著增加.结论:构建的重组腺病毒可介导ERK-2基因在原代大鼠生长板软骨细胞中高表达.
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血小板上清液对家兔生长板软骨细胞增殖的影响
目的:观察人血小板上清液(hunan platelet supernatant,hPS)对体外培养幼兔生长板软骨细胞增殖与分化的影响.方法:原代分离培养兔生长板软骨细胞并稳定传代,同时添加不同体积分数的hPS,采用WST-8染色法检测细胞增殖倍数;Alcian Blue法测基质蛋白多糖含量;羟脯氨酸法测定软骨细胞胶原产量,酶动力学方法测定碱性磷酸酶(ALP)活性.结果:体积分数5%hPS组显著促进软骨细胞的增殖以及基质蛋白多糖的合成,但形态上失去其软骨表型.各体积分数组hPS对总胶原的合成与对照组相比差异没有显著性意义,hPS抑制了ALP的活性.结论:hPS可以有效地促进生长板软骨细胞的增殖,抑制其肥大化.
