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大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导脂肪间充质干细胞体外分化
背景:研究表明,骨髓间充质干细胞具有在体外分化为肺泡上皮细胞的可能性,但至今未见脂肪间充质干细胞与肺泡上皮细胞通过长时间Transwel共培养,诱导脂肪间充质干细胞分化的相关报道.目的:观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞的可行性.方法:取3只SPF级健康雌性SD大鼠作为供体,分离、提取、培养、鉴定脂肪间充质干细胞.实验分2组:实验组(脂肪间充质干细胞与大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN进行Transwel共培养)和对照组(脂肪间充质干细胞单独培养).共培养第21天,倒置显微镜观察各组脂肪间充质干细胞的形态变化,对脂肪间充质干细胞进行SP-C免疫荧光染色,荧光显微镜下观察蛋白表达并拍照,采用Image pro plus 6.0软件分析荧光表达的积分吸光度值.结果与结论:①共培养21 d,实验组的脂肪间充质干细胞形态由长梭形、成纤维细胞样,逐渐转化为卵圆形、多边形,对照组脂肪间充质干细胞形态保持成纤维细胞样;②荧光显微镜下观察,实验组脂肪间充质干细胞可见红色荧光表达,对照组无红色荧光表达,实验组的荧光表达较对照组增强(P<0.05);③结果表明,大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN能够在长时间(21 d)共培养条件下,诱导脂肪间充质干细胞分化为肺泡上皮细胞.
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辛伐他丁通过PI3K/Akt通路上调血红素加氧酶-1表达对抗脂多糖诱导的RLE-6TN细胞损伤
目的:观察辛伐他丁(SIM)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)损伤的保护作用及机制.方法:以离体培养RLE-6TN细胞为研究对象,观察SIM对RLE-6TN细胞血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响及机制.在HO-1表达高时间点建立LPS炎症损伤模型,通过检测细胞活力和培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,观察SIM对LPS诱导的RLE-6TN细胞炎症损伤的保护作用.结果:与正常对照组相比,SIM组Akt磷酸化水平显著增加,并在处理后2h达到峰值.SIM可显著上调RLE-6TN细胞HO-1表达,mRNA和蛋白分别在处理后6h和12h到达峰值.PI3K/Akt抑制剂LY294002可显著抑制SIM对RLE-6TN细胞HO-1的上调作用.LPS处理可降低RLE-6TN细胞活力和增加培养液中LDH含量.SIM可显著减轻LPS对RLE-6TN的损伤,但这种保护作用可以被HO-1抑制剂Zn-pp显著抑制.结论:SIM可通过PI3K/Akt通路上调HO-1表达并对抗LPS诱导的RLE-6TN细胞损伤.
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烟尘慢性染毒致肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化离体实验研究
目的 建立模仿肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)暴露于云锡炼厂烟尘环境的离体研究模型.方法 以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高、低剂量染毒组和空白对照组.前2组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养.从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性.采用透视电镜观察细胞超微结构,流式细胞术观察细胞周期,免疫印迹法及免疫组织化学观察各组细胞肺表面活性蛋白(SP)-B、SP-C、鼠双微体2(MDM2)蛋白、脆性组氨酸三联体(FHIT)蛋白的改变.结果 染毒24 h后即可观察到烟尘对RLE-6TN细胞超微结构造成损伤,主要表现为板层小体变性且数量减少,以及细胞凋亡和坏死;转化后的细胞由圆形或类圆形铺路石样生长变为长梭形.高、低剂量染毒组细胞培养至25代时软琼脂克隆形成检测实验均呈阳性,克隆形成率分别为3.33‰和1.67‰;继续培养至35代观察高、低剂量染毒组克隆形成率分别为12.50‰和10.00‰,空白对照组始终没有克隆形成.高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P＜0.01),但与烟尘染毒剂量相关性无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪检测示高、低剂量染毒组G2/M期+S期的比例较空白对照组增高.高、低剂量染毒组第25、30代细胞MDM2蛋白阳性、SP-B及FHIT蛋白阴性,而空白对照组同代细胞MDM2蛋白阴性、SP-B及FHIT蛋白阳性.高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞示SP-C失表达,空白对照组SP-C有表达.结论 ATⅡ长期暴露于云锡炼厂烟尘中可导致其恶性转化.ATⅡ特异性蛋白SP-B、SP-C、FHIT失表达,MDM2阳性表达可作为RLE-6TN细胞转化的参考指标.
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Vimentin,CTGF和AQP5在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化模型中的表达
目的 观察波形蛋白(Vimentin)、结缔组织生长因子(conective tissue growth factor,CTGF)和水通道蛋白5 (Aquaporin5,AQP5)在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)恶性转化模型中的表达.方法 以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高剂量染毒组、低剂量染毒组和空白对照组.高、低剂量染毒组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养.从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性.采用透射电镜观察细胞超微结构,以免疫印迹法及免疫组织化学法观察各组细胞肺表面活性蛋白SP(-B)、SP-C、波形蛋白(Vi-mentin)、结缔组织生长因子(CTGF)、水通道蛋白5(AQP5)表达.结果 从形态改变、软琼脂克隆形成实验及肺泡表面活性蛋白(SP)-B、SP-C的表达上发现经烟尘诱导,RLE-6TN细胞超微结构会发生改变,且高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P＜0.01),但与烟尘染毒水平相关性无统计学意义(P＞0.05).免疫组织化学显示高、低剂量染毒组第30代细胞CTGF阳性、SP-B阴性,空白对照组CTGF阴性、SP-B阳性.Western blot示高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞及空白对照组Vimentin和AQP5均为阴性.结论 云锡炼厂烟尘导致ATⅡ恶性转化模型中CTGF表达阳性,但Vimintin及AQP5的表达呈阴性.
