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烟尘慢性染毒致肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化离体实验研究
目的 建立模仿肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)暴露于云锡炼厂烟尘环境的离体研究模型.方法 以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高、低剂量染毒组和空白对照组.前2组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养.从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性.采用透视电镜观察细胞超微结构,流式细胞术观察细胞周期,免疫印迹法及免疫组织化学观察各组细胞肺表面活性蛋白(SP)-B、SP-C、鼠双微体2(MDM2)蛋白、脆性组氨酸三联体(FHIT)蛋白的改变.结果 染毒24 h后即可观察到烟尘对RLE-6TN细胞超微结构造成损伤,主要表现为板层小体变性且数量减少,以及细胞凋亡和坏死;转化后的细胞由圆形或类圆形铺路石样生长变为长梭形.高、低剂量染毒组细胞培养至25代时软琼脂克隆形成检测实验均呈阳性,克隆形成率分别为3.33‰和1.67‰;继续培养至35代观察高、低剂量染毒组克隆形成率分别为12.50‰和10.00‰,空白对照组始终没有克隆形成.高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P＜0.01),但与烟尘染毒剂量相关性无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪检测示高、低剂量染毒组G2/M期+S期的比例较空白对照组增高.高、低剂量染毒组第25、30代细胞MDM2蛋白阳性、SP-B及FHIT蛋白阴性,而空白对照组同代细胞MDM2蛋白阴性、SP-B及FHIT蛋白阳性.高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞示SP-C失表达,空白对照组SP-C有表达.结论 ATⅡ长期暴露于云锡炼厂烟尘中可导致其恶性转化.ATⅡ特异性蛋白SP-B、SP-C、FHIT失表达,MDM2阳性表达可作为RLE-6TN细胞转化的参考指标.
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Vimentin,CTGF和AQP5在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化模型中的表达
目的 观察波形蛋白(Vimentin)、结缔组织生长因子(conective tissue growth factor,CTGF)和水通道蛋白5 (Aquaporin5,AQP5)在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)恶性转化模型中的表达.方法 以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高剂量染毒组、低剂量染毒组和空白对照组.高、低剂量染毒组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养.从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性.采用透射电镜观察细胞超微结构,以免疫印迹法及免疫组织化学法观察各组细胞肺表面活性蛋白SP(-B)、SP-C、波形蛋白(Vi-mentin)、结缔组织生长因子(CTGF)、水通道蛋白5(AQP5)表达.结果 从形态改变、软琼脂克隆形成实验及肺泡表面活性蛋白(SP)-B、SP-C的表达上发现经烟尘诱导,RLE-6TN细胞超微结构会发生改变,且高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P＜0.01),但与烟尘染毒水平相关性无统计学意义(P＞0.05).免疫组织化学显示高、低剂量染毒组第30代细胞CTGF阳性、SP-B阴性,空白对照组CTGF阴性、SP-B阳性.Western blot示高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞及空白对照组Vimentin和AQP5均为阴性.结论 云锡炼厂烟尘导致ATⅡ恶性转化模型中CTGF表达阳性,但Vimintin及AQP5的表达呈阴性.
