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人纤溶酶原丝氨酸蛋白酶( SP )活性区基因的克隆、表达与功能研究
目的 克隆和表达人纤溶酶原( plasminogen,Plg)的丝氨酸蛋白酶( SP)活性区基因μplg,并进行重组蛋白的纯化及功能探索. 方法 用PCR方法从pDNR-plg质粒上扩增μplg,构建原核表达载体pET22b(+)-μplg,IPTG诱导重组蛋白表达后复性,再经Ni+-NTA树脂亲和层析纯化,通过与双歧杆菌外膜蛋白Serpin的共孵育实验来探索μPlg的功能. 结果 PCR成功扩增出了680 bp的人纤溶酶原Plg的SP区基因μplg,测序正确后与表达载体pET22b(+)重组,重组质粒pET22b(+)-μplg在大肠杆菌BL21中成功表达出分子量约为35 kD的μPlg蛋白质,经纯化后的蛋白纯度高达约90%以上,与Serpin蛋白共孵育后得到了二者的复合物. 结论 人纤溶酶原μPlg的成功克隆、表达及纯化对于研究SP区功能和与双歧杆菌的黏附作用有重要意义.
关键词： 人纤溶酶原 丝氨酸蛋白酶(SP) 活性区 μplg 质粒构建 -
人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性
目的 在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性.方法 根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化.表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性.结果 筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150 mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长.结论 hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性.
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第三代溶栓药物
溶栓药物的应用彻底改革了急性心肌梗死病人的治疗.链激酶、尿激酶加肝素和阿司匹林,在症状发生后的初始6小时内应用,能使院内死亡率降低一半以上,且大大改善病人的长期生存.虽然这些第一代纤维蛋白溶解剂能有效溶栓,但不具有纤维蛋白特异性,它们也使循环中的纤溶酶原转变为纤溶酶.因血栓与血浆中的纤溶酶原处于平衡状态,故血栓内纤溶酶原也逐渐耗竭.此种"纤溶酶原偷窃"可减弱血凝块溶解.且链激酶具有免疫原性,可引起药物抗性、发热和变态反应.为此,开发了链激酶和酰化人纤溶酶原复合物(茴香酰化纤溶酶原链激酶活化剂复合物)或阿尼普酶(anistreplase).但临床试验中未能满足与纤维蛋白结合和纤溶效能比链激酶更大的希望,且仍可引起抗原反应.
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苏灵局部止血及体外抑制FXa+t-PA诱导纤溶酶原激活作用
目的 探讨苏灵(SL)体外对人血浆凝固时间的影响、局部给药对小鼠剪尾后出血的促凝作用及体外对纤溶系统的影响.方法 将磷酸钠缓冲液、SL溶液和人凝血酶溶液与人血浆混合,血凝仪测定其凝固时间;将分别浸有磷酸钠缓冲液(溶媒组)、SL溶液和人凝血酶溶液的纱布敷于小鼠剪尾后的伤口上,计算出血时间和出血量,评价各组的止血效果;采用SDS-PAGE方法检测SL对人纤溶酶原的降解作用,吸光度法测定SL体外对FXa+t-PA诱导的纤溶酶原激活作用的影响.结果 SL和人凝血酶能明显缩短人血浆凝固时间,并能明显缩短小鼠剪尾的止血时间及减少出血量,与溶媒组比较差异有统计学意义(P＜0.05);SL对人纤溶酶原没有直接的裂解作用,不激活人纤溶酶原;SL可抑制FXa+t-PA诱导的人纤溶酶原体外激活.结论 SL具有良好的局部止血效果,其部分作用机制可能与抑制FXa激活纤溶系统有关.
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从血液制品组分Ⅲ中制备人纤溶酶原
目的建立制备人纤溶酶原方法.方法血液制品组分Ⅲ经磷酸盐缓冲液溶解、聚乙二醇(PEG)4 000沉淀及8 000 r/min离心后,Lysine Sepharose-4B和Sephacryl S200层析纯化人纤溶酶原.结果纯化的纤溶酶原在SDS-PAGE电泳上呈单一条带.结论本纯化方法简单易行适合规模化生产.
