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利用凝集素芯片检测多囊肾病特异iPS细胞表面糖谱的研究
目的:建立一套凝集素芯片检测活体iPS细胞表面糖谱的方法.方法:以ADPKD-iPS为对象,运用不同活细胞染料,尝试不同的染色时间,找到佳的iPS细胞与凝集素芯片结合的实验方案.结果:利用SYBR green,染色30min可以获得佳的信号强度和信噪比.结论:已成功建立了一套利用凝集素芯片对活体iPS细胞进行表面糖谱检测的方法.
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应用凝集素芯片检测非小细胞肺癌细胞膜表面糖链表达
目的 应用凝集素芯片检测非小细胞肺癌细胞系A549和H460细胞膜表面糖链表达类型.方法 用胶原酶Ⅱ消化非小细胞肺癌细胞系,对提取的细胞进行荧光标记,利用凝集素对糖链的特异亲和性捕获细胞,激光扫描仪检测细胞膜表面糖链表达.结果 腺癌A549和大细胞肺癌H460除LTL和DBA这两个凝集素位点没有捕获到细胞外,其余各点均捕获到细胞.结论 根据凝集素的亲和特异性表明,非小细胞肺癌细胞膜表面糖链类型主要有:唾液酸、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、甘露糖和半乳糖糖链,为建立癌症细胞膜表面糖链表达谱和寻找肺癌分子靶向治疗的药物作用位点提供理论依据.
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应用凝集素芯片检测胃正常黏膜上皮细胞与胃癌细胞膜表面糖链表达
目的 应用凝集素芯片检测胃正常黏膜上皮细胞系GES-1和胃癌细胞系SGC7901、MKN45细胞膜表面糖链表达,并对芯片上捕获的细胞进行初步的免疫荧光研究.方法 用胶原酶Ⅱ消化细胞系,利用芯片上的凝集素位点对糖链的亲和特异性捕获荧光标记的细胞,激光共聚焦扫描仪扫描检测细胞膜表面糖链表达.结果 在大多数凝集素位点上,这几种细胞均显示出荧光信号;在凝集素位点WBA、EEL、MAH-Ⅱ上均未显示荧光信号;其中,与GES-1相比,胃癌细胞系SGC7901和MKN45在LTL、HHL位点上基本没有荧光信号.结论 根据凝集素的亲和特异性说明,这几种细胞系膜表面共同表达的糖链包括:唾液酸、乙酰葡萄糖/葡萄糖、乙酰半乳糖/半乳糖、甘露糖等糖链.其中,胃癌细胞系SGC7901和MKN45可能较少表达岩藻糖.
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基于凝集素芯片的蛋白质糖基化修饰检测方法
目的：建立针对组织和血清样本中蛋白质糖基化的凝集素芯片检测方法，并结合凝集素印迹法验证，以实现样品间糖基化修饰差异的高通量筛选。方法：采用包含91种凝集素的凝集素芯片，利用生物素标记的组织总蛋白质样品，比较实验的重复性及不同上样量的芯片实验效果。利用生物素标记的去高丰度蛋白质血清和全血清样品，比较两者芯片实验的检出情况及全血清样品不同上样量的芯片实验效果。以优条件筛选癌组织与癌旁组织样品之间及不同疾病患者血清样品之间的糖基化修饰差异，采用凝集素印迹法验证凝集素芯片实验结果。结果：芯片重复性良好（r>0.94），组织样品在0.625～1.250μg/mL时实验效果较佳；去高丰度蛋白质血清和全血清样品以高浓度上样时（≥20μg/mL），两者检出相近。标记后的全血清样品取2μL稀释至150μL时，实验效果佳。筛选出检测信号有差异的凝集素经凝集素印迹法验证，结果与芯片检测一致。结论：该凝集素芯片实验体系稳定、可靠，可用于筛选临床样本间的糖基化修饰差异，有助于发现疾病相关的糖蛋白生物标志物。
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肝细胞生长因子(HGF)诱导肝癌Huh7细胞发生上皮间质转化(EMT)后细胞膜表面糖蛋白糖谱的变化
目的 应用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面转移相关的特征性糖谱.方法 应用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导建立肝癌上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)细胞模型.通过凝集素芯片比较诱导前后细胞膜的糖谱改变,采用凝集素印迹和荧光细胞凝集素免疫组化方法验证芯片结果.结果 诱导后细胞对凝集素ACL、BPL、JAC、MPL、PHA-E、SBA和SNA的亲和作用减弱,而对凝集素AAL、ConA、DBA、GSLⅡ、ECL、HAL、LCA、LTL、NML、NPL、PHA-L、PTLⅡ和WFL的亲和作用增强.提示诱导后肝癌细胞表面出现了黏蛋白T/Tn抗原、平分型N-乙酰葡萄糖胺、α2,6唾液酸和末端a或β连接的N-乙酰半乳糖胺结构减少;而末端和核心岩藻糖、高甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺p 1,6分支和复杂型寡糖分支结构增多.结论 肝癌细胞发生EMT过程中细胞膜表面糖链结构改变,提示糖链结构与肝癌的转移密切相关,为有效控制肝癌转移、改善预后提供了新思路.
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非转移性和转移性人肝癌血清糖蛋白凝集素亲和谱的比较研究
目的 应用凝集素亲和技术寻找肝癌转移相关特征性血清糖蛋白凝集素亲和谱,并探讨其生物学意义.方法 本研究利用含有13种肿瘤相关的凝集素集合芯片技术,比较研究了非转移性和转移性人肝癌血清糖蛋白凝集素亲和谱,同时采用多重凝集素印迹方法验证凝集素芯片结果.计量资料数据采用双样本异方差 t检验,进行两两比较.结果 研究证明,与非转移人肝癌血清相比,转移性肝癌血清糖蛋白对麦胚凝集素( wheat germ agglutinin,WGA)、黑接骨木凝集素(sambucus nigra lection,SNA)、红腰豆凝集素(phaseolus vulgaris erythroagglutinin,PHAE)和欧曼陀罗凝集素(datura stramonium lectin,DSA)的亲和作用增强(P＜0.05).提示转移性肝癌血清糖蛋白出现了增多的唾液酸( sialic acid,sia)、N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine,GlcNAc)、平分型GlcNAc及多天线、偏二天线糖链结构.结论 血清糖蛋白聚糖链的变化与肿瘤侵袭和转移密切相关,为临床筛选肝癌侵袭及转移相关的糖标记提供了重要参考.
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凝集素芯片法分析桥本氏甲状腺炎患者外周血DC细胞膜糖蛋白的表达
目的 通过凝集素芯片法筛选桥本氏甲状腺炎(HT)患者外周血树突状细胞(DC)差异表达的膜表面糖蛋白,了解其在HT中的表达变化.方法 通过制备包含有32种凝集素的凝集素芯片对16例HT患者和22例健康者外周血DC细胞膜表面糖蛋白的表达进行分析;凝集素耦联葡聚糖拉下相应差异表达的糖蛋白并进行质谱鉴定;同时应用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、Western blot法和流式细胞术对HT患者外周血DC中该糖蛋白的mRNA、蛋白表达及Galectin-9+ DC比例进行分析.后通过ELISA法检测DC与CD8+T细胞孵育上清液中IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B浓度.结果 凝集素芯片检测结果显示凝集素脱落酸素(ABA)对应的糖蛋白在HT组显著低于健康组(P＜0.01).对凝集素ABA耦联葡聚糖拉下后洗脱的蛋白进行质谱鉴定,结果显示,众多洗脱蛋白中半乳糖结合蛋白-9 (Galectin-9)所占比例较为丰富;随后通过qRT-PCR和Westem blot进一步验证Galectin-9在HT组DC中的表达低于健康组;流式细胞术结果则显示HT组DC Galectin-9low比例高于健康组,且其均能较健康组诱导CD8+T细胞产生3种高水平杀伤因子.结论 HT患者外周血Galectin-9lowDC可能与HT相关.
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凝集素芯片技术在常见妇科肿瘤诊断中的应用
目的探讨人血清糖蛋白的糖链结构信息在常见妇科肿瘤临床诊断中的价值。方法收集123例临床血清样本，其中乳腺癌31例、宫颈癌24例、卵巢癌19例、健康女性体检者49例，通过自制的包含15种不同凝集素的凝集素芯片来测定人血清中糖蛋白的糖链结构信息，利用SPSS 15.0统计软件进行分析，采用逐步判别分析法建立关于样本分组的判别函数方程。结果首先建立用于区分健康者与肿瘤患者的判别函数方程，对健康样本和肿瘤样本的回判正确率分别为85.7%、83.8%，总的判别正确率为84.6%；然后针对肿瘤组再建立用于区分乳腺癌、宫颈癌和卵巢癌的判别函数方程，结果对乳腺癌、宫颈癌和卵巢癌的回判正确率分别为96.8%、75.0%、78.9%，总的判别正确率为85.1%。结论人血清糖蛋白的糖链结构信息与妇科肿瘤存在相关性，基于凝集素芯片检测结果建立的判别函数方程对于临床血清样本的诊断判别具有一定的参考价值。
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应用凝集素芯片检测胃癌细胞膜表面糖链表达
目的:应用凝集素芯片检测胃癌细胞株AGS和SGC-7901细胞膜表面糖链表达,并分析差异糖链与胃癌侵袭转移的相关性.方法:用胰酶消化收集细胞,加入荧光标记试剂对细胞进行荧光标记,利用凝集素芯片上的凝集素位点对糖链的亲和特异性捕获荧光标记的细胞,激光共聚焦扫描仪检测,凝集素流式细胞术验证,进而通过Transwell和划痕修复实验比较细胞侵袭转移能力.结果:在大多数凝集素位点上,AGS和SGC-7901这两种细胞荧光信号未出现明显差异.与SGC-7901细胞相比,AGS细胞显示出较强的LEL和MALⅡ信号.甘露糖、唾液酸、乙酰葡萄糖/葡萄糖、乙酰半乳糖/半乳糖在两种细胞中均有表达.AGS细胞含有较多的多聚乳糖胺和α2-3唾液酸,且AGS细胞侵袭转移能力要强于SGC-7901细胞.结论:高侵袭转移潜能的胃癌细胞表达特征性的多聚乳糖胺和α2-3唾液酸.基于凝集素芯片进行细胞膜糖图谱检测,将有助于筛选出肿瘤相关的糖链标志物和肿瘤诊断治疗.
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抗HBV治疗后血清学转换中血清糖蛋白聚糖谱的变化及其临床意义
目的 探索慢性乙型肝炎患者经抗病毒治疗后HBeAg和HBsAg血清学转换过程中血清糖蛋白聚糖谱的特征性改变,并探讨其生物学意义.方法 在去除高丰度蛋白质的基础上,应用凝集素芯片技术比较分析正常对照组、HBeAg阳性非治疗组、HBeAg转换治疗组、HBsAg阴转治疗组的血清糖蛋白聚糖亲和谱,并用凝集素印迹方法验证芯片结果.计量资料采用单因素方差分析,进而进行Student-Newman-keuls (SNK)法两两比较.结果 HBeAg阳性非治疗组与正常对照组相比,对16种凝集素的亲和荧光明显减弱(P值均＜0.05),提示在HBV活跃复制的HBeAg阳性非治疗组患者的血清糖蛋白聚糖谱中末端和核心岩藻糖、黏蛋白T/Tn抗原、α-N乙酰半乳糖胺(GalNac α)、末端β 1-4和β-D链接半乳糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNac)、平分型GlcNac、甘露糖、唾液酸糖链结构明显降低.HBeAg转换治疗组与HBeAg阳性非治疗组相比,包括豌豆凝集素、桑橙凝集素和上述16种凝集素对血清糖蛋白聚糖的亲和荧光增强(P值均＜ 0.05),说明降低的这些血清糖蛋白聚糖结构又恢复到或略高于对照组水平.HBsAg阴转治疗组与HBeAg转换治疗组相比,血清糖蛋白聚糖对橙黄网孢盘菌凝集素、尾穗苋凝集素、螺旋蜗牛凝集素、螺旋圆口螺凝集素、蓖麻凝集素、番茄凝集素、茄块茎凝集素、红腰豆凝集素、眼镜蛇罗非鱼凝集素和红花菜豆凝集素结合的亲和下降,接近对照组(P值均＜0.05),提示血清糖蛋白中末端岩藻糖、GalNacα、末端β 1-4链接半乳糖、平分型GlcNac等结构下降到接近对照组水平;而对凝集素槲寄生凝集素、扁豆凝集素、雪花莲凝集素、豌豆凝集素、桑橙凝集素和木菠萝凝集素的亲和荧光增强(P＜ 0.05),提示末端β-D-半乳糖残基、核心岩藻糖结构在HBsAg阴转治疗组明显增多.结论 血清糖蛋白聚糖变化与HBeAg和HBsAg血清学转换密切相关.核心岩藻糖、末端β-D-半乳糖残基结构可作为抗HBV治疗后HBsAg阴转相关的糖标志物.
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机械牵张力对人成骨样细胞糖链影响的初步研究
目的:研究机械牵张力对人成骨肉瘤MG - 63细胞糖蛋白糖谱表达的影响.方法:以Flexcell细胞应力培养系统对人成骨肉瘤MG-63细胞施以形变率为12％,加载时长分别为4、8、12、24h的周期性张应变,利用凝集素芯片技术筛选出糖蛋白糖谱中差异表达的糖蛋白糖链,比较不同加载时长下成骨样细胞表面糖谱的变化.结果:8h加力组表达差异明显,在加力后实验组凝集素Jacalin、LEL、GSL-Ⅰ、DBA、RCA、VVA、ACA的亲和作用增强,而对凝集素WFA、EEL、AAL、LCA、STL的亲和作用减弱,提示在机械牵张力作用下成骨样细胞表面可能出现增多的黏蛋白T/Tn抗原；Ⅰ-抗原；N-乙酰半乳糖胺(包括α1-3链接方式),α及β链接半乳糖结构和减少的岩藻糖α1-2链接半乳糖；核心岩藻糖；N-乙酰葡糖胺结构等.结论:通过凝集素芯片技术研究发现受机械应力刺激后的成骨样细胞表面糖链变化与时间呈相关性,可推测在加载8h后成骨样细胞已具备了某些骨化的早期表现.在加载4h后成骨样细胞便出现对信号转导的重要调节修饰,为研究骨改建信号转导发生机制提供了糖组学理论支持.
关键词： 凝集素芯片 人成骨肉瘤MG-63细胞 机械牵张力 糖蛋白 -
超低温冷冻对人精子糖被的影响
目的 研究超低温冷冻对人精子糖被的损伤.方法 利用凝集素芯片比较精子冷冻前、后的凝集素结合谱.结果 通过比较冷冻保护剂和冷冻方法对精子复苏率的影响,确定了CryoSpermTM以及一步熏蒸法为佳精予冷冻试剂和方法;通过凝集素芯片比较精子冷冻前、后的凝集素结合谱观察到在91种凝集素中,有33种发生了显著变化,其中,冷冻后显著下调的有9种,显著上调的有24种,并且显著下调的MAA及显著上调的PSA、ABA和AIA经流式验证,结果与芯片一致.结论 精子糖被经过冷冻之后发生了显著变化,对精子起保护作用的唾液酸大量丢失,同时也暴露糖链内部的糖基,因此精子糖被的冷冻损伤可能是由于低温冷冻引起精子生育力低下的原因之一.
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关于凝集素芯片检验糖蛋白的方法与应用
目的:探讨分析凝集素芯片检验糖蛋白的方法与应用.方法:用染色液Cy3标记标准糖蛋白,血清白蛋白,应用凝集素识别特异糖链的原理建立方法,同时分析肝细胞及癌细胞膜蛋白的差异.结果:优封闭剂为含1%牛血清白蛋白的10mmol/L磷酸盐缓冲液.佳孵育条件为60%湿度的培养箱孵育3小时,真空干燥箱37℃干燥3小时.佳孵育缓冲液为含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲10mmol/L.在显微镜下观察,不同结合位点的细胞形态不一,且肝癌细胞的增殖速度较快.凝集素芯片检验糖蛋白结果和标准的糖蛋白链组成一致,证明了芯片检测的可行性.结论:凝集素芯片检测糖蛋白可以时时动态的,且稳定性和特异性较好,为以后的细胞癌变等进一步研究提供依据,值得推广使用.
