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新型汽油防爆剂MMT对人前列腺细胞系PC-3M的凋亡作用
2000年1月1日,我国颁布新的汽油标准,改用甲基环戊二烯羰基锰(MMT)替代四乙基铅作为新的汽油防爆添加剂,使人群,尤其是交通警察、炼油厂工人、加油站职工和繁华马路附近居民等通过大气接触MMT的机会大大增加[1].研究表明锰在肾脏和前列腺中蓄积量高[2].因此对新型大气污染物MMT的前列腺毒性进行研究,阐明其作用机制十分必要.本实验利用人前列腺细胞系PC-3M研究MMT对PC-3M细胞的影响.
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PSCA表达及其单抗对PC-3M细胞生长与凋亡影响的观察
目的:观察前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)在人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞的表达状况以及PSCA特异性单克隆抗体(PSCA-mAb)对PC-3M细胞生长和凋亡的影响.方法:采用细胞免疫化学方法检测PSCA在PC-3M的表达;以0～1.0 μg/mL浓度的PSCA-mAb作用PC 3M细胞0～96 h,采用细胞生长曲线、四甲基噻唑氮蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析PC-3M细胞生长及凋亡的变化.结果:PSCA在PC-3M细胞膜和细胞质呈阳性表达;0.1 μg/mL PSCA-mAb作用时的细胞生长抑制率为(11.3±2.2)％,0.2 μg/mL为(27.5±3.4)％,0.4μg/mL为(39.4±5.8)％,0.6 μg/mL为(47.7±7.4)％,0.8 μg/mL为(69.3士8.2)％,1.0 μg/mL为(70.8±9.3)％,细胞凋亡率为0.1 μg/mL为(8.7±1.4)％,0.2 μg/mL为(12.3±2.8)％,0.4 μg/mL为(21.6±3.2)％,0.6 μg/mL为(33.6±4.9)％,0.8 μg/mL为(41.4±5.8)％,1.0 μg/mL为(42.3±6.1)％,均显著高于相应对照组细胞生长抑制率和凋亡率,P均＜0.01;PSCA-mAb作用PC-3M细胞24 h的生长抑制率为(47.8±6.4)％,48 h为(59.4±7.3)％,72 h为(70.3±7.9)％,96 h为(71.1±9.0)％,细胞凋亡率24 h为(33.6±4.3)％,48 h为(36.3±5.1)％,72 h为(42.7±5.7)％,96 h为(43.4±6.3)％,均高于相应的对照组细胞生长抑制率和凋亡率,P均＜0.01.MTT及FCM分析结果表明,PSCA-mAb在0.6μg/mL作用72 h时,细胞生长抑制率为(71.5±6.2)％,凋亡率为(44.4±5.5)％,均达到大.结论:PSCA在人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞呈阳性表达;PSCA-mAb能够时间-剂量依赖性地抑制PC-3M生长和诱导其凋亡.
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叶黄素对人前列腺癌PC-3M细胞增殖抑制作用
目的 探讨叶黄素对体外培养人前列腺癌PC-3M细胞增殖的抑制作用及机制.方法 选择人前列腺癌PC-3M细胞为研究对象,随机分为5组:0(对照组)、5、10、20、40 μmol/L叶黄素组,采用噻唑蓝法检测PC-3M细胞增殖抑制率,采用流式细胞术检测PC-3M细胞周期,采用荧光显色法观察细胞形态,紫外分光光度法检测细胞上清液中caspase-3的含量.结果 与对照组比较,各剂量叶黄素组PC-3M细胞增殖抑制率明显升高,具有剂量和时间依赖性(P＜0.01);与对照组比较,叶黄素10、20、40 μmol/L剂量组PC-3M细胞G1期细胞比例明显增加,G2M期细胞比例明显减少(P＜0.01);与对照组比较,叶黄素各剂量组PC-3M细胞形状发生明显变化,细胞变圆,核碎裂且核染色质凝聚,凋亡小体形成,且随剂量增加凋亡数显著升高;与对照组比较,各剂量叶黄素组PC-3M细胞上清液中caspase-3含量明显升高,呈剂量效应关系(P＜0.05).结论 叶黄素可抑制体外培养的人前列腺癌PC-3M细胞的增殖,诱导其凋亡,其机制可能与叶黄素增加PC-3M细胞caspase-3表达有关.
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人前列腺癌PC-3M细胞中与转移相关靶标蛋白的筛选
目的 探讨早期诊断前列腺癌和逆转前列腺癌转移的标志物.方法 采用一维SDS-PAGE结合高效液相色谱-串联质谱的方法分离并鉴定PC-3M细胞中的膜蛋白.结果 在严格的过滤参数条件下(当Charge+1,Xcorr≥1.9;当Charge+2,Xcorr≥2.2;当Charge+3,Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1),PC-3M细胞中鉴定出2 023个蛋白,其中1391(69%)个蛋白经过基因本体评注(GOA)显示为已知细胞组分,其余为未知细胞组分.在已知细胞组分中527(38.30%)个蛋白为膜蛋白或者膜相关蛋白,其中18.32%的蛋白被预测至少有1个跨膜区,49.62%的蛋白有1～3个跨膜区,19.08%的蛋白有4～9个跨膜区.9.92%蛋白预测有≥10个跨膜区.除了已知的与膜相关的蛋白,很多新的蛋白也被鉴定,其中包括假设蛋白和一些cDNA序列.结论 一种明显独特的质膜蛋白表达模式存在于高转移前列腺癌细胞系中.这将帮助进一步理解前列腺癌侵袭和转移的分子机制.并且为寻找前列腺癌转移相关的靶标分子提供实验基础.
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锌对前列腺癌细胞PC-3M凋亡的影响
目的:探讨锌对前列腺癌细胞PC-3M凋亡的影响.方法:分别选用不同浓度ZnSO4·7H2O(终浓度分别为6.25、15、25、50、100、150、200、250及300 μmol·L-1)作用于PC-3M细胞24 h,用MTT法筛选对PC-3M细胞增殖抑制的有效浓度,利用吖啶橙/溴化乙锭染色、DNA ladder及流式细胞术检测PC-3M细胞凋亡情况.结果:MTT显示,锌的浓度在250 μmol·L-1时,PC-3M细胞存活率显著低于对照组(P＜0.01).Zn2+浓度达250 μmol·L-1时,相差显微镜下细胞形态变化明显,细胞变长,并伸出较长的突起,细胞分裂相明显减少,细胞数量较对照组明显减少.吖啶橙/溴化乙锭染色显示,对照组细胞形态为规则的圆形,细胞膜光滑无皱缩和发泡,呈现均匀的绿色,偶可见橙色细胞(自然凋亡细胞);Zn2+(250 μmol·L-1)作用后,相差显微镜下可观察到较多早期凋亡细胞,细胞多为圆形,但细胞膜较对照组粗糙,细胞呈绿色,细胞核中有鲜绿色的斑点;也可观察到较多的晚期凋亡细胞,细胞形状不规则,细胞膜粗糙,有较多突起,被吖啶橙染成橙色,细胞中有鲜亮的橙色斑点.DNA ladder可见梯形条带出现;流式细胞术显示亚二倍体峰的出现,细胞凋亡率为13.3%.上述各项指标均显示PC-3M细胞的凋亡水平明显高于对照组(P＜0.05).结论:高Zn2+可以抑制前列腺癌细胞生长并诱导前列腺癌细胞凋亡.
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双氢青蒿素对前列腺癌细胞PC-3M生长的影响及其机制探讨
目的:观察双氢青蒿素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M细胞凋亡和血管内皮生长因子( VEGF)表达的影响. 方法:不同浓度(0、25、50、100 umol/L)的双氢青蒿素分别作用于PC-3M细胞48 h,MTT法检测细胞生长活性；流式细胞仪测定细胞凋亡率；分光光度法检测细胞凋亡过程中caspase-3、caspase-8活性变化；半定量RT-PCR法检测PC-3M细胞内VEGF mRNA的表达；Western印迹法检测细胞VEGF蛋白表达. 结果:双氢青蒿素能显著抑制PC-3M细胞的增殖,与对照组(0 umol/L)的细胞凋亡率(2.92±0.45)％相比,各剂量组(25、50、100 umol/L)的细胞凋亡率[(8.85±0.74)％,(12.83±0.84)％,(18.65±1.24)％]显著增加,caspase-8[(0.47±0.05) U/ugvs(1.22±0.15) U/ug,(1.76±0.07) U/ug,(2.91±0.24) U/ug]、caspase-3[ (0.44±0.07) U/ugvs (0.95±0.08) U/ug,(1.48±0.14)U/μg,(2.92±0.45) u/μg]活性显著增加,呈剂量依赖性(P＜0.01).PC-3M细胞内VEGF mRNA的表达和蛋白表达呈剂量依赖性降低. 结论:双氢青蒿素能显著抑制体外PC-3M细胞的生长,并促进其凋亡,机制可能与增加凋亡蛋白酶和抑制VEGF表达有关.
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内皮素A受体拮抗剂BQ123对前列腺癌PC-3M细胞增殖与凋亡的影响
目的:观察内皮素A受体拈抗剂BQ123对转移性前列腺癌(PCa)PC-3M细胞株增殖与凋亡的影响,初步探讨内皮索A受体拮抗剂埘转移性PCa细胞的体外抗肿瘤效应. 方法:实验分为两组,对照组为PC-3M细胞及含灭活小牛血清的F12/RMP11640培养液;实验组为PC-3M细胞加入等量的1 μmol/L BQ123.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、划痕损伤实验、细胞迁移实验观察BQ123对人PCa PC-3M细胞株增殖的抑制效应,利用AnnexinV-FITC/PI染色和流式细胞术检测BQ123诱导PC-3M细胞凋亡的作用及其与细胞周期的关系. 结果:MTT比色法结果显示BQ123随着作用时间的增加,对PC-3M的抑制率分别为24 h 22.32%、48 h 44.88%和72 h 64.47%,表现出良好的时效关系(P<0.05),划痕损伤实验结果提示:实验组PC-3M细胞的迁移距离分别为12 h(103.42±75.63)μm、24 h(243.75±121.53)μm和48 h(422.07±36.01)μm,均低于对照组的12 h(162.93±19.87)μm、24 h(317.19±43.19)μm和48 h(692.74±40.84)μm(P<0.05).细胞迁移实验中实验组穿入下室的PC-3M细胞为(79.2±9.58)个,亦明显少于对照组的(92.6±5.94)个(P<0.05);Annexin V-FITC/PI双染色法的结果显示对照组PC-3M细胞凋亡率为(9.38±1.37)%,实验组PC-3M细胞凋亡率为(15.03±0.93)%,差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期实验的结果显示实验组各期细胞比例与对照组相比差异不显著(P>0.05).结论:BQ123对PCa PC-3M细胞株的生长、迁移和侵袭能力均有明显的抑制作用,且可以诱导PC-3M细胞凋亡,可为PCa治疗的研究提供一种新的思路.
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多肽K237对PC-3M细胞增殖及bax、bcl-2mRNA表达的影响
目的:研究多肽K237对体外培养的雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞的抑制作用,及其可能的作用机制. 方法:将培养的PC-3M细胞分为4组:实验组(分别以50、100、200μmol/L的多肽K237处理48 h)和对照组(K237浓度为0μmol/L),采用MTT法观察多肽K237对前列腺癌PC-3M细胞增殖的影响,用RT-PCR法检测bax、bcl-2 mRNA表达的变化. 结果:不同浓度的多肽K237处理48 h后,PC-3M细胞形状变圆,体积变小,胞质透亮度下降,部分细胞脱落悬浮于培养液中.在50、100、200 μmol/L的多肽K237作用48h后,MTT法检测的细胞生长抑制率分别为(12.6±0.95)%、(17.8±0.99)%、(27.2±1.12)%.RT-PCR结果显示:50、100、200μmol/L实验组和对照组的bax/β-actin值分别为0.919±0.071、0.971±0.083、0.992±0.102,(0.889±0.06),bel-2/β-actin值分别为0.896±0.085、0.791±0.084、0.764±0.702,0.922±0.097,3组中上述两项指标均较对照组有明显变化(P均<0.01),其中,bax mRNA表达水平上调,而bcl-2 mRNA表达水平下调,上述作用呈现剂量效应关系. 结论:多肽K237可能通过影响bax、bcl-2 mRNA的表达来诱导PC-3M细胞凋亡,从而抑制前列腺癌细胞的增殖.
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茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的影响
目的 探讨茶多酚对人前列腺癌PC-3M细胞中调控细胞凋亡的生存素(Survivin)mRNA和蛋白表达的影响.方法 在人前列腺癌PC-3M细胞培养器皿中分别加入用完全培养液稀释的0、40、60、80μg/ml茶多酚溶液,24、48h后应用RT-PCR和Western blot检测并比较Survivin mRNA、蛋白表达水平.结果 与0μg/ml组相比,40μg/ml组加入茶多酚48h后Survivin mRNA、蛋白表达水平均明显下调(均P＜0.05);60、80μg/ml组加入茶多酚24、48h后Survivin mRNA、蛋白表达水平均明显下调(均P＜0.05),其中80μg/ml组下调为明显(均P＜0.05);大致呈剂量、时间依赖性(均P＜0.05).结论 茶多酚可下调Survivin mRNA和蛋白表达水平,促进人前列腺癌PC-3M细胞调亡,在一定范围内呈剂量、时间依赖性.
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TFAR19蛋白协同米非司酮对前列腺癌PC-3M细胞凋亡的影响
目的 初步探讨TFAR19协同米非司酮(MIF)对前列腺癌PC-3M细胞凋亡的影响.方法 构建TFAR19真核表达载体,用脂质体介导的方法转染PC-3M细胞.MTT法检测5、10、20、50和100 μmol·L-1 MIF作用于前列腺癌PC-3M细胞24～96 h的吸光度(A)值.在转染TFAR19的细胞中加入20 mol·L-1 MIF培养24、48 h,MTT比色法检测细胞增殖,原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡率,透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变.结果 构建了PCI-neo-TFAR19真核表达载体并在转染的PC-3M细胞中得到了瞬时表达.MTT实验表明,与对照组相比,5、10 μmol·L-1 MIF组的A 值差异无统计学意义(P>0.05),20、50和100 μmol·L-1 MIF组的A值差异有统计学意义(P<0.01),MIF对前列腺癌PC-3M细胞的抑制作用呈时间、剂量依赖性;转染PCI-neo-TFAR19并加入20 mol·L-1 MIF后,与对照组及单独应用MIF组相比,细胞生长明显受到抑制(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征(细胞体积缩小,核皱缩、碎裂,染色质呈块状边集等).结论 TFAR19蛋白能够协同米非司酮促进前列腺癌PC-3M细胞凋亡,有望成为前列腺癌的辅助治疗药物.
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PDCD5蛋白联合米非司酮对前列腺癌细胞增殖及相关基因表达的影响
目的 观察PDCD5蛋白协同米非司酮(MIF)对前列腺癌细胞增殖及相关基因表达的影响.方法 MTT法分别检测10、20、50和100μmol/L MIF作用于PC-3M细胞24～96 h的吸光度(A)值.扩增包含PDCD5序列的真核表达载体PCI-neo-PDCD5,用脂质体介导的方法转染前列腺癌PC-3M细胞.在转染PDCD5的细胞中分别加入10、20 μmol/L MIF,继续培养24 h,MTT比色法检测细胞增殖,RT-PCR方法检测细胞增殖相关基因CyclinDl、Ki-67的表达.结果 MTT实验表明,与对照组相比,10 μmol/L MIF组的A值差异无统计学意义(P<0.05),20、50和100 μmol/L MIF组的A值显著降低(P<0.05),MIF对前列腺癌PC-3M细胞的抑制作用呈剂量依赖性;PDCD5真核表达载体成功转染PC-3M细胞并得到了瞬时表达,转染PCI-neo-PDCD5并加入MIF后,与对照组及单独应用MIF组相比,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05),增殖相关基因CyclinD1、Ki-67表达降低.结论 PDCD5蛋白能够协同米非司酮抑制前列腺癌PC-3M细胞增殖,可能是通过调节某些增殖相关基因的表达来实现的,并有望成为前列腺癌的辅助治疗药物.
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TRAIL抑制人前列腺癌细胞PC-3M体外生长的实验研究
目的观察TRAIL对前列腺癌细胞PC-3M的生长抑制作用.方法采用MTT法检测不同浓度TRAIL对人非激素依赖性前列腺癌细胞株 PC-3M的生长抑制率, 原位末端酶标记技术检测细胞凋亡.免疫组化法观察bcl-2的表达.结果 TRAIL可有效地抑制PC-3M细胞生长,具有时间、浓度依赖性特点.经药物作用后,前列腺癌细胞凋亡明显增多,凋亡率随作用时间的延长而增高, PC-3M细胞中的bcl-2基因表达无显著变化.结论 TRAIL蛋白可显著抑制前列腺癌细胞PC-3M生长,其诱导细胞凋亡不依赖bcl-2基因表达.
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p53AIP1基因转染对PC-3M人前列腺癌细胞生物学特性的影响
目的 观测p53调节的凋亡诱导蛋白1 (p53AIP1)对PC-3M人前列腺癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡、侵袭及迁移的影响.方法 构建真核载体pDC316-p53AIP1,并进行双酶切及PCR鉴定.在LipofectamineTM 2000介导下转染至体外培养的PC-3M人前列腺癌细胞系中,Western blot法检测其表达,CCK-8法检测PC-3M细胞增殖情况,流式细胞术分析PC-3M细胞周期变化和annexinV-FITC/PI结合流式细胞术凋亡情况,TranswellTM实验检测p53AIP1对细胞迁移及侵袭能力的影响.结果 成功构建了pDC316-p53AIP1真核表达载体,重组质粒转染PC-3M细胞后,Western blot法检测p53AIP1在PC-3M细胞中有表达,CCK-8结果显示表达的p53AIP1能抑制PC-3M细胞增殖(P＜0.05),流式细胞术检测细胞周期阻滞在S/G2-M期(P＜0.05)且p53AIP1能促进PC-3M细胞凋亡,TranswellTM侵袭和迁移实验显示p53AIP1使细胞侵袭迁移能力均降低(P＜0.05).结论 p53AIP1抑制PC-3M细胞的周期、增殖、侵袭及迁移,并能促进其凋亡.
关键词： p53调节的凋亡诱导蛋白1 PC-3M细胞 基因转染 增殖 侵袭
