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荧光原位杂交技术(FISH)在泌尿系统肿瘤领域的应用
一、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术概述1969年,Gall和Pardue等首次将同位素探针用于原位杂交实验,获得成功.1987年,染色体原位抑制杂交法的创建,使FISH技术得以迅速发展.随后,Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素等非放射性物质标记探针,创立了双色FISH技术.1990年,Nederlof等用3种荧光素成功探测出了3种以上的靶位DNA序列,从而宣告了多色FISH技术的问世.
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单克隆抗体CD44-生物素-亲和素技术构建组织工程软骨修复猪膝关节负重区软骨缺损
目的 观察单克隆抗体CD44-生物素(Biotin)-亲和素(Avidin)绑定(CBA)技术,在体外构建的组织工程软骨移植修复猪膝关节负重区软骨缺损的效果.方法 分3组构建组织工程软骨:常规组:壳聚糖三维支架+软骨细胞;Biotin-Avidin绑定(BA)技术组:生物素+亲和素化壳聚糖三维支架+软骨细胞;CBA技术组:生物素化单抗CD44+亲和素化壳聚糖三维支架+软骨细胞.分4组修复猪膝关节负重区软骨全层缺损:A组植入常规组织工程软骨;B组植入BA技术构建的组织工程软骨;C组植入CBA技术构建的组织工程软骨;D组植入自体软骨.12周后取标本行大体观察并行Moran评分;生物力学方法评估标本弹性模量和刚度;Western blot检测新生软骨组织内的Ⅱ型胶原(colⅡ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)目的蛋白含量;对标本行苏木素-伊红染色、甲苯胺蓝染色并行Wakitani评分.结果 Moran大体评分,D组为(4.48 ±0.23)分,与C组差异无统计学意义(P＞0.05),但优于A、B两组(P＜0.05);D组弹性模量为(20.61 ±±2.02) mPa,刚度为(72.28±6.16) N/mm、colⅡ及aggreean目的蛋白含量比值分别为1.59 ±0.14和1.44±0.13,均优于其他组(P＜0.05);组织学染色及Wakitani评分均显示D组修复效果较好.结论 BA绑定技术比常规接种方法所构建组织工程软骨对猪膝关节负重区软骨缺损修复效果好,但是比较而言,单克隆抗体CBA绑定技术所构建组织工程软骨修复效果更佳,虽仍未达到自体移植修复水平.
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肾组织冰冻切片中血红素氧合酶-1的免疫组织化学检测
目的 探讨大鼠肾脏组织冰冻切片中血红素氧合酶-1(HO-1)的免疫组织化学检测方法及其干扰因素.方法 腹腔内注射钴原卟啉(CoPP)诱导Wistar大鼠(n=24)肾脏高表达HO-1；比较常规链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法(n=8)、SP+蛋清封闭法(n=8)和Dako EnVision二步法(n=8)消除非特异性染色的效果,并通过检测已知阳性组织的HO-1表达加以验证.结果 Western blot法检测证实CoPP成功诱导全部24只Wistar大鼠肾脏高表达HO-1.用免疫组织化学法检测HO-1在大鼠肾脏组织中的表达时,可见(1)正常大鼠肾组织仅部分大血管区有内源性过氧化物酶的着色,能被0.3％H202·甲醇或3％ H202消除；(2)正常大鼠肾组织有丰富的内源性生物素表达,常规SP法染色(n=8)出现较强的非特异性染色；SP+蛋清封闭法染色(n=8)不能消除非特异性染色,反而有放大作用；Dako EnVision二步法(n=8)可以有效消除非特异性染色,良好显示HO-1在肾脏组织中的分布.结论 内源性生物素是冰冻切片免疫组织化学染色的主要干扰因素；常规SP法或加用蛋清封闭不能消除其干扰；EnVision二步法可以有效避免非特异性干扰,良好的显示HO-1在阳性肾脏组织中的表达.
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单抗CD44-生物素-亲和素系统提高软骨细胞与支架黏附能力的研究
目的 观察单抗CD44-生物素(Biotin) -亲和素(Avidin)绑定系统在构建组织工程软骨中能否提高软骨细胞与支架的黏附能力.方法 分别制备软骨细胞二维和三维培养体系,分3组:A:壳聚糖+软骨细胞；B:生物素+亲和素化壳聚糖+软骨细胞；C:生物素化单抗CD44+亲和素化壳聚糖+软骨细胞.分别测定细胞展平面积、细胞接种脱落率、细胞增殖率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan )、sox9的mRNA表达,组织学切片观察壳聚糖支架内细胞黏附生长情况.结果 细胞展平面积、细胞增殖率及ColⅡ、aggrecan、sox9的mRNA表达量皆为:C组＞B组＞A组(P＜0.05).细胞接种脱落率:A组为C组的3.71倍、为B组的2.17倍,而B组为C组的1.71倍,A组＞B组＞C组(P＜0.05).组织切片显示细胞在支架内C组增殖旺盛、胞外基质表达较丰富,A组增殖较弱、胞外基质表达较弱,B组介于C与A组间.结论 单抗CD44-Biotin-Avidin绑定系统能比Biotin-Avidin绑定系统更显著的提高软骨细胞与支架的黏附能力,促进组织工程软骨种子细胞的增殖和软骨细胞表型的表达.
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生物素化去细胞猪主动脉瓣构建组织工程心脏瓣膜研究
目的 制备生物素化去细胞猪主动脉瓣,通过生物素-亲和素系统提高去细胞瓣膜的细胞黏附效率.方法 将10 mmol/L的生物素和5 g/L亲和素分别依次与去细胞猪主动脉瓣反应,制备表面含亲和素的生物素化去细胞猪主动脉瓣.将1.0×105生物素化和未生物素化的骨髓基质干细胞,分别种植于上述改性前后的去细胞瓣膜,应用Hoechst 33258试验确定细胞的黏附效率,扫描电镜观察细胞在瓣膜上的生长.结果 生物素和亲和素能链接到去细胞猪主动脉瓣,生物素化骨髓基质于细胞在表面含亲和素的生物素化去细胞猪主动脉瓣上的黏附效率(55.73±4.53)%显著高于各对照组分别为(31.20±3.94)%、(30.75±3.15)%和(28.51±4.52)%,且扫描电镜示细胞在去细胞猪主动脉瓣膜表面形成一细胞层,生长良好.结论 去细胞猪主动脉瓣可生物素化,并能以亲和素为中介,与细胞表面生物素的结合,增加细胞的黏附效率,且不影响细胞的生长.
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环氧化酶-2在膀胱癌中的表达及其临床意义
近年来研究表明,环氧化酶-2(COX-2)是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶,在肿瘤的发生发展中起着重要作用[1].我们应用链霉素亲生物素过氧化酶免疫组织化学技术(SP法)探讨膀胱癌组织中COX-2的表达情况,并研究表达结果与膀胱癌的组织学分级、临床分期的关系.
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Cdx2对胃癌细胞生物学性状的影响
目的 观察Cdx2对人胃癌细胞MGC-803生物学性状的影响.方法 利用脂质体将pCMV-Cdx2-HA和pCMV-HA质粒分别转染MGC-803细胞,应用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测MGC-803细胞中Cdx2基因的表达;应用体外实验及流式细胞仪分别检测Cdx2对MGC-803的侵袭力、黏附力、增殖力、迁移力和凋亡率的影响.结果 转染pCMV-Cdx2-HA质粒的MGC-803细胞中可以检测到高Cdx2的表达,其侵袭能力[穿膜细胞数:(64.33±11.94)个/视野下降到(23.93±8.95)个/视野]、黏附能力[(1.172±0.042)]、增殖力[(26.13±1.60)%]和迁移能力[(42.87±2.19)%]较对照组明显降低(P＜0.05),而且凋亡率升高,48 h和72 h的凋亡率分别为(11.40±0.36)%、(9.72±0.50)%(P＜0.05).结论 Cdx2高表达对MGC-803具有抑制其侵袭转移的作用,并促进肿瘤细胞的凋亡.
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用ELISA法测定基因转殖酵母菌发酵液中生物素
目的:采用一种简便、高灵敏度、高准确度的ELISA方法,对基因转殖可制造生物素的酵母菌发酵液中生物素含量的直接定量.方法:采用猪肺炎霉浆菌包被酶标板,再依次结合兔抗猪肺炎霉浆菌血清及生物素化羊抗兔IgG,形成生物素的固定相,用竞争抑制法测定生物素含量,各步实验条件均经优化.结果:测定的线性范围为50～2000ng/L,灵敏度IC50=410ng/L,检测限为83 ng/L,线性相关系数r=-0.990;样品液1:1000稀释后,可消除基质效应的影响直接测定,加标平均回收率为101.13%.结论:用本文ELISA法测定基因转殖酵母菌发酵液中生物素的方法简便,结果可靠.
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一种新型的基因表达水平检测方法
目的:建立一种简便、特异的检测组织血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)受体基因表达变化的半定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT- PCR)技术.方法:采用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取组织总RNA,用生物素(biotin, B)标记的AngⅡ受体的特异引物进行RT-PCR扩增,PCR产物纯化后,再与过氧化物酶标记生物素竞争性地结合包被到酶标板上的亲和素(avidin),经过显色反应并测定其吸光度值可反映特异性PCR产物量,从而推断模板核酸中AngⅡ受体基因的相对含量.结果:异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取组织总RNA的质量较高;PCR的适反应条件为94 ℃变性30 s、59 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s,循环33次,后72 ℃延伸5 min;酶标仪所测阴性对照和扩增产物光密度之差能够反映不同模板中AngⅡ受体基因的相对含量.结论:该方法是一种简便、特异、可行的半定量RT-PCR基因检测技术.
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非荧光法与荧光法芯片检测细菌感染的研究
目的研制一种用于快速检测急症常见感染细菌的芯片反应系统.方法应用生物信息学技术,设计检测细菌的探针和聚合酶链反应扩增引物,探针点制成寡核苷酸芯片,待测样本经扩增并标记生物素或CY5荧光素后与芯片杂交,再经链酶亲和素-碱性磷酸酶显色反应后,获得肉眼可见的杂交信号,或通过荧光检测仪读出样本的检测结果.结果建立了针对临床急症患者标本的非荧光法与荧光法芯片检测系统,芯片的检测灵敏度(大肠埃希菌)为10～100 CFU/反应体系.结论两种方法不仅能快速、灵敏地检测靶细菌感染,且重复性好、信号强及不易出现非特异信号.生物素酶联显色芯片法由于更为经济、简便而有重要的临床价值.
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疑难病研究-生物素酶缺乏症
报道1例生物素酶缺乏症病例,探讨因生物素酶缺乏症所致的临床特征和诊治方法.3岁男童,因脱发、皮疹6月,进行性肢体无力3个月就诊.运用尿气相色谱-质谱联用及干燥血液生物素酶活性测定进行筛查,诊断符合生物素酶缺乏症.经生物素补充治疗,患儿3 d后全身情况逐渐好转,1个月后基本恢复正常.生物素酶缺乏症常导致严重皮肤与神经系统损害,早期诊断与治疗是挽救患儿生命的关键.
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生物素标记人免疫球蛋白IgG重链的效果评估
目的 对生物素标记的人免疫球蛋白IgG重链的效果进行评估和研究.方法 将生物素与人免疫球蛋白IgG重链以各种不同的比例进行反应,然后让连接有抗人免疫球蛋白IgG重链抗体的微球颗粒与其反应,应用Luninex200仪器来测定其反应结果,终来评估生物素与待标记的人免疫球蛋白IgG重链反应的效价.结果 生物素与人免疫球蛋白IgG重链的重量比例适当时,微球颗粒上的平均荧光强度(MFI值)强,而其他比例时,微球颗粒上的平均荧光强度呈下降趋势.结论 生物素标记人免疫球蛋白IgG重链应有适当的比例,使被标记的生物素尽可能的多,同时又避免过多的生物素造成空间位阻影响.
关键词： 生物素 人免疫球蛋白IgG重链 -
优化微生物法快速测定婴幼儿配方乳粉中4种水溶性维生素
目的 探索建立优化微生物法快速测定婴幼儿配方乳粉中4种水溶性维生素(维生素B12、叶酸、生物素、肌醇).方法 建立样品的统一处理方案,制备均匀的样品待测溶液,并以此制备4种水溶性维生素样品工作溶液,制备试验菌悬液冻存于1.2 mL PP小管,-80℃冻存备用,培养基的试验体积由国标的10 mL缩小为600 μL.将培养物混合均匀后使用酶标仪进行读数,根据每管的吸光值从标准曲线中查得对应的维生素含量,并对方法的重复性和加标回收率进行试验.结果 该方法中维生素B12、叶酸和生物素的检测范围分别为0.125 ～ 0.750、0.06 ～0.36、0.04～0.24 ng/mL,肌醇的检测范围为0.65 ～ 3.90μg/mL,相关系数分别为0.998 7、0.999 3、0.999 9和0.998 7,检出限分别为0.1、2.0、2.0μg/100g和2.0 mg/100g,RSD分别为5.07％、6.71％、2.55％和7.38％,回收率分别为99.1％、91.1％、93.4％和95.4％.共对8份婴幼儿配方乳粉试验样品进行检测,在1.0d内做4种水溶性维生素测定试验,可以完成4种维生素的样品处理和试验操作,经过1.5～2.5 d的培养和读数,可以得出4种维生素测定的结果,整个过程只需要2.5～3.5 d.结论 采用优化微生物法测定婴幼儿配方乳粉中4种水溶性维生素的试验设计具有检测周期短、操作步骤简便、结果准确性与重现性高的优势.
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ABC-ELISA法与快速ELISA试剂盒法检测华支睾吸虫抗体的结果比较
ABC(Avidin-Biotin-Peroxidase complex)技术,即生物素-亲和素-酶结合物技术,80年代开始已广泛应用于各种免疫学检测.这种技术利用生物素(biotin)与亲和素(avidin)之间具有的高度亲和力以及1分子亲和素可与4分子生物素结合的特性,大大增强检测的敏感性.为了进一步地改进目前应用于华支睾吸虫病防治现场的ELISA试剂盒诊断方法,本实验用ABC-ELISA法检测华支睾吸虫感染循环抗体,并与快速ELISA试剂盒法(简称快速ELISA法)进行比较.
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口腔链球菌摄取生物素与口内白色念珠菌生长的关系
为了探讨口腔细菌生态平衡机制,本文检测了4株口腔链球菌(S. salivarius, S. sanguis, S.mutans和S. mitior)和白色念珠菌生长对生物素的依赖性.结果显示白色念珠菌和口腔链球菌的生长绝对依赖生物素,前者大半数生长需要生物素约10 pmol/L,其大生长率所需生物素约为100 pmol/L;而后者大半数生长需生物素为5～25 pmol/L.正常人血清和唾液中生物素含量约为212～294 pmol/L.生物素饥饿状态下的白色念珠菌和口腔链球菌,以及唾液离心沉淀物(绝大多数为细菌)摄取生物素具温度依赖性,而代谢抑制剂(叠氮化合物、氰化物和醋酸碘)和某些抗生素(杆菌肽、短杆菌肽、万古霉素和二性霉素)具选择性抑制效应,提示生物素的摄取和跨膜转运是一依赖能量的主动过程.用唾液沉淀物和口腔链球菌吸收培养基中的生物素或与白色念珠菌共培养,显著抑制白色念珠菌的生长.这些实验提供证据显示口腔优势菌可能通过竞争生物素等营养成份,抑制白色念珠菌生长,以维持口腔微生物之生态平衡.进一步实验显示处于饥饿状态的白色念珠菌摄取生物素具可饱和性和特异性.从饱和曲线算出主动摄取生物素的半数大初速率(1/2 Vmax)所需生物浓度,即Km值为(0.79±0.11) μmol/L(平均数±标准差,n=8);叠氮钠(5 mmol/L)处理后,其Km值增到(2.39±0.64) μmol/L(平均数±标准差,n=3).生物素之结构同源分子,如脱硫生物素、生物胞素、甲基酯生物素和对硝基苯酯生物素等竞争性抑制其主动摄取生物素,但是2-亚氨基生物素却完全无抑制作用.在生物素摄取充足的白色念珠菌(在含20 nmol/L生物素培养基中生长),生物素主要通过简单的弥散方式进入菌体内.由于血清中的生物素含量在pmol/L到几个nmol/L之间,白色念珠菌在体内可能主要通过主动摄取生物素机制满足其营养代谢需求.这些实验研究结果可能为发展抗白色念珠菌感染新举措提供某种理论基础.
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张应变诱导分泌型miR－27 a调控GRK6在高血压内皮细胞异常增殖中的机制研究
目的：本研究旨在揭示高血压条件下血管平滑肌细胞（ vascular smooth muscle cells ， VSMCs ）响应高周期性张应变后调控血管内皮细胞（ endothelial cells ， ECs）异常增殖的可能机制。方法：在体条件下，构建腹主动脉缩窄型高血压大鼠模型；体外条件下，用FX－4000T张应变加载系统对VSMCs施加5％和15％的周期性张应变。结果：与正常组相比，高血压组大鼠胸主动脉ECs中GRK6的表达水平显著降低，ECs增殖水平显著上升；体内和体外条件均存在VSMCs 源性MPs （ VSMC－MPs）；miR－27a存在于 VSMC－MPs 中，并可靶向调控GRK6；15％周期张应变条件下产生的 VSMC－MPs 中miR－27a 的含量显著高于5％组，作用于ECs 后，15％组ECs 中miR－27a的水平显著高于5％组， GRK6的表达水平显著低于5％组， ECs 的增殖能力显著高于5％组；用从转染生物素连接的miR－27a （B－miR－27a）的VSMCs培养液中分离得到的MPs作用于ECs，在ECs中可以检测到B－miR－27a的存在；miR－27a正向调控ECs 的增殖，GRK6负向调控ECs 的增殖。结论：在高血压条件下，高周期性张应变促进VSMCs 分泌miR－27a，其可通过VSMC－MPs 转移到ECs 中，抑制GRK6表达，并终诱导ECs 异常增殖。
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生物素靶向显影探针Biotin-S-S-Rhodol对乳腺癌细胞的靶向显影作用
目的：对新型生物素靶向显影探针（Biotin-S-S-Rhodol,3a）的靶向显影性能进行分析。方法采用紫外吸收光谱和荧光光谱分析谷胱甘肽（GSH）处理后3a的光谱特性；采用不同浓度GSH处理3a，荧光光谱分析3a对GSH的敏感性；采用流式细胞术和荧光倒置显微镜观察生物素预处理前后MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞和Hs 578Bst细胞对3a的摄取率和靶向显影性能；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)初步分析3a对MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞和Hs 578Bst细胞的毒性。结果3a的强吸收峰在510 nm处，在544 nm处荧光发射信号强；荧光光谱结果显示随着GSH浓度（0~6 mmol/L）处理浓度提高，544 nm波长处的荧光强度升高；MDA-MB-231、MCF-7细胞对3a的摄取率明显高于Hs 578Bst细胞；3a能实现乳腺癌细胞专一性成像，成像清晰；2~20μmol/L 3a对人正常乳腺细胞无明显毒性，可在一定程度上抑制MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞存活。结论3a能通过生物素介导专一靶向乳腺癌细胞，成像清晰，对正常乳腺细胞毒性极低，有一定的抑制乳腺癌细胞存活作用。
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抗癌胚抗原单抗与生物素及链霉亲和素偶联物的制备及性能鉴定
目的研究抗癌胚抗原(CEA)单抗与生物素及链霉亲和素(streptavidin,SA)偶联物的制备方法.方法将CEA单抗按抗体与生物素活化酯物质的量之比为l:15～1:50进行生物素化.抗CEA单抗与SA的偶联采用3-(2-吡啶二巯基丙酸)-N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)化学偶联法制备.抗CEA单抗偶联物的生物活性及免疫活性分别采用间接ELISA方法和放射免疫分析法进行测定.结果生物素化单抗每分子抗体中约偶联3分子生物素,具有良好的SA结合活性,经SDS-PAGE电泳证实为单一蛋白条带,仍保留95%的免疫活性.SA每分子中含有1～2个巯基,而抗CEA单抗每分子中含有2～3个3-(2-吡啶二巯基丙酸)-N-琥珀酰亚胺酯间接ELISA方法证实偶联物具有良好的生物素结合活性,SDS-PAGE电泳显示单抗-SA偶联物相对分子质量为210 000左右,仍保留着原单抗活性的70%左右.结论所制备的两类抗CEA单抗偶联物基本保持完整的特异性结合肿瘤CEA的性质,可为进一步的预定位显像和治疗应用提供可靠的靶向载体.
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链酶亲和素-生物素ELISA检测人心肌肌钙蛋白T
目的建立人心肌肌钙蛋白T (cTnT)链酶亲和素-生物素(SAB)双抗体夹心酶联免疫分析(ELISA)方法,诊断急性心肌损伤性疾病.方法以固相化单抗3F7捕捉样品中cTnT,生物素化3H12单抗为检测抗体,加入SA-HRP,显色.根据已知不同浓度标准cTnT显色后D(λ)值的标准曲线,检测待测样品cTnT含量.结果 cTnT的低检测值为0.15 ng/ml,批内变异系数为3.8%,批间变异系数为11.2%,回收率为98%.35例急性心肌损伤患者cTnT含量为(0.68±0.17) ng/ml,明显高于52例正常人对照组(0.20±0.03) ng/ml(P<0.01).结论本方法灵敏、特异、稳定,可用于临床急性心肌损伤疾病的诊断.
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ABS-ELISA检测46例结直肠癌患者血清可溶性CD137L浓度
目的 建立一种灵敏、可靠的检测血清可溶性CD137L(sCD137L)浓度的方法. 方法建立链霉亲和素-生物素-ELISA检测27例结肠癌患者、19例直肠癌患者以及15例健康对照者血清sCD137L水平. 结果 46例结直肠癌患者血清sCD137L的平均浓度为(1091.48±519.32)pg/ml,显著高于健康对照组[(4.36±2.94)pg/ml](P<0.01).结论 结直肠癌患者血清sCD137L水平显著升高,血清sCD137L浓度在结直肠癌的诊断及疗效评估、预后判断中可能具有一定的临床价值.
