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姜黄素对急性高眼压家兔的视网膜神经节细胞的保护作用
目的：探讨姜黄素（ Curcumin，Cur）对实验性急性高眼压家兔眼视网膜神经节细胞（ retinal ganglion cells，RGCs）的保护作用。方法：将24只家兔按照随机等分的方法分为3组，即姜黄素干预青光眼模型组（姜黄素组）、未给予姜黄素干预的青光眼模型组（青光眼组）和不经任何干预措施的正常对照组（正常组）。应用前房灌注升高眼压的方法给姜黄素组和青光眼组的家兔建立急性高眼压模型，急性高眼压模型造模成功后，给予姜黄素组家兔玻璃体腔注射比例浓度为0．1mg／0．1mL的姜黄素，青光眼组家兔玻璃体腔注射相同体积的生理盐水，每天注射1次，共7d。正常对照组不做上述任何处理直接取眼球。实验完成后，通过免疫组织化学法检测三组家兔眼球视网膜神经节细胞Thy－1的表达并计数。结果：姜黄素组和正常组的视网膜神经节细胞Thy－1表达之间差异无统计学意义（P＞0．05）；青光眼组和正常组的视网膜神经节细胞Thy－1表达差异有显著统计学意义（P＜0．01）。姜黄素组、正常组和青光眼组的视网膜神经节细胞密度分别为20．3±2．7、21．5±1．8和15．1±2．3个／高倍视野。结论：在姜黄素作用的急性高眼压模型家兔的实验中，姜黄素可以通过提高视网膜神经节细胞的Thy－1的表达，表明其在一定程度上能够降低急性高眼压状态下家兔视网膜神经节细胞的损伤，推测姜黄素可能对视网膜在特定情况下具有一定的保护作用。
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猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构
目的建立视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)的体外培养方法，并研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用，为RGCs的体外实验研究奠定基础. 方法进行猪视网膜细胞混合体外培养和神经节细胞的纯化培养，观察神经节细胞生长状态及轴突生长情况，研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用. 结果视网膜细胞混合培养时，神经节细胞生长良好，纯化后的神经节细胞间连接减弱，细胞存活时间缩短. 结论视网膜细胞混合培养有利于神经节细胞的贴壁和生长.
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锌对微波辐照后脂质过氧化反应的影响
目的以锌作为防护因素研究微波对体外培养的猪视网膜神经节细胞的脂质过氧化损伤作用及耐受剂量.方法体外培养猪视网膜神经节细胞,按微波辐照强度不同分为对照组,30mW.cm-2组,60mW.cm-2组及各辐照剂量加锌组,微波理疗机于微波屏蔽室内辐照1h,分别于辐照后0和72h观察细胞形态变化,测定超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量.结果微波辐照后,细胞有聚集现象,部分细胞轴突消失,细胞MDA含量明显增高,SOD降低,加锌各组光镜下细胞形态变化不明显,MDA含量较未加锌组有所恢复,SOD活性也增高;细胞辐照后继续培养72h,30mW.cm-2组MDA含量降低,60mW.cm-2组MDA与辐照组无明显差别,加锌后再继续培养72h,则两组细胞MDA均比辐照后降低,SOD活性增强.结论微波可引起视网膜神经节细胞脂质过氧化损伤,锌可提高细胞的抗氧化能力,在一定程度上减轻微波对视网膜神经节细胞的过氧化损伤,其作用效果与作用时间有关.
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微波对培养视网膜神经节细胞过氧化损伤的实验
0 引言近年来,随着微波在工农业生产、医疗卫生、通讯、家用电器以及军事等领域的广泛应用,微波的医学防护受到极大的关注.尽管微波的损伤是多方面的,但眼睛则是敏感、重要的靶器官.多年的研究表明,微波可以对眼睛造成明显损害[1].研究微波对体外培养的视网膜神经节细胞的损伤及其作用机制,可为进一步研究微波的眼底损伤及防护提供一定的实验依据.
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锌对微波致猪视网膜神经节细胞损伤的防护作用
目的 探讨微波对体外培养的猪视网膜神经节细胞的脂质过氧化损伤作用及耐受剂量，为进一步研究微波的眼底损伤机制及其防护提供一定的实验依据. 方法 体外培养猪视网膜神经节细胞，按微波辐照强度分为对照组，30 mW*cm-2组，60 mW*cm-2组及各辐照剂量加锌组，微波理疗机于微波屏蔽室内辐照1 h，辐照后立即于光镜及电镜观察细胞形态变化，测定超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)活性. 结果 微波辐照后，细胞有聚集现象，部分细胞轴突消失，电镜可见线粒体及内质网肿胀，细胞MDA活性明显增高，SOD降低，加锌各组光镜下细胞形态变化不明显，电镜显示线粒体轻度肿胀，嵴完整，MDA活性有所恢复，SOD活性增高. 结论 微波可引起视网膜神经节细胞脂质过氧化损伤，锌可提高细胞的抗氧化能力，在一定程度上减轻微波对视网膜神经节细胞的过氧化损伤.
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藏红花素抑制谷氨酸盐诱导的视网膜神经节细胞凋亡
目的 研究藏红花素通过影响Ca2+内流对谷氨酸盐诱导的视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡的影响及可能机制.方法 分离大鼠RGCs,以0.1、1 mmol/L的谷氨酸盐刺激RGCs 24、48 h,建立RGCs凋亡模型,并用0.1、1.0、3.0 μmol/L浓度梯度藏红花素分别处理.Annexin V-FITC/PI双标检测细胞凋亡率,Fluo-3/AM荧光标记Ca2+检测胞内钙离子浓度,Western blot检测藏红花素对胞内钙离子介导的凋亡信号分子calpain和CaMKⅡ表达的影响.JC-1荧光染色和Western blot分别检测藏红花素对线粒体膜电位和线粒体凋亡相关信号分子Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2/Bax表达的影响.结果 0.1 mmol/L谷氨酸盐刺激24 h,RGCs细胞凋亡率与对照组差异无统计学意义(P＞0.05);而当刺激48 h时,RGCs的凋亡率达到(43.050±2.616)％,差异有统计学意义(P＜0.01).高剂量谷氨酸盐(1 mmol/L)刺激24、48 h的RGCs凋亡率为(46.450±1.061)％和(45.500±3.253)％,较对照组均显著增加,差异有统计学意义(P＜0.01).用1 mmol/L谷氨酸盐刺激RGCs 12 h后加入0.1、1.0、3.0μmol/L藏红花素再处理12h,不同浓度藏红花素均可显著抑制细胞凋亡(P＜0.01),且抑制效率具有剂量依赖性.另外,1.0μmol/L藏红花素组的谷氨酸盐诱导的胞外Ca2+内流减少及钙依赖蛋白Calpain1和CaMKⅡ的表达减弱,线粒体膜电位增高,Caspase-3和Caspase-9的表达减少,Bcl-2/Bax表达上调.结论 藏红花素抑制谷氨酸盐诱导的RGCs凋亡,其机制可能与阻止胞外Ca2+内流,抑制钙依赖的凋亡信号通路和线粒体凋亡信号通路有关.
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脑源性神经营养因子在正常兔眼视网膜的表达
目的:观察脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在兔眼视网膜组织中的表达.方法:利用BDNF抗体通过免疫组织化学方法,观察免疫反应物质在兔眼视网膜组织中的分布.结果:BDNF在兔眼视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)、内核层细胞、外核层细胞均有表达.结论:RGC不仅是BDNF的靶细胞,其自身也表达BDNF.旁分泌、自分泌方式产生的BDNF也参与了RGC的调节.
关键词： 视网膜神经节细胞 免疫化学 @脑源性神经营养因子 -
枸杞多糖对体外培养的视网膜神经节细胞氧化应激损伤的保护作用
目的 观察枸杞多糖对体外培养的视网膜神经节细胞氧化应激损伤的保护作用.方法 实验分为正常对照组、H2O2组、H2O2+LBP(40 mg/L)组.正常对照组:DMEM完全培养基常规培养;H2O2组:含体积分数10％ FBS的DMEM高糖培养基培养,同时加入200 μmol/L H2O2溶液造成氧化应激损伤模型;H2O2+ LBP(40 mg/L)组:用含10％ FBS和200 μmol/L H2O2的DMEM培养基培养,同时加入不同浓度的枸杞多糖(10 mg/L,20 mg/L,40 mg/L)进行干预,终选用40 mg/L枸杞多糖进行保护.使用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和AnnexinV-FITC法检测细胞存活率及凋亡率.结果 MTT结果显示,H2O2能够降低RGC-5细胞活性,并呈浓度依赖性,200 μmol/LH2O2作用24 h后RGC-5细胞活性为正常对照组的50％,继续加入不同浓度LBP (10 mg/L,20 mg/L,40 mg/L)干预后细胞存活率分别为52.5％、62.8％和68.6％,与H2O2组相比较细胞存活率明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).AnnexinV-FITC检测结果显示,正常对照组、H2O2组、H2O2+ LBP(40 mg/L)组细胞凋亡率,分别为4.90％、32.35％、24.21％,各组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 枸杞多糖对RGC-5氧化应激损伤有保护作用.
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神经生长因子在眼科疾病中对视网膜神经节细胞的生理作用
神经生长因子（NGF）是一种在靶细胞合成，并内源性地参与交感神经和感觉神经元的发育、稳定和再生的营养因子。由于其和它的受体原肌球蛋白相关激酶受体A（TrkA）和p75被证实广泛存在于大多数的房水组织中包括晶状体、玻璃体、脉络膜、虹膜以及小梁网中，而在视网膜中，NGF被视网膜神经节细胞（RGCs）、双极神经元、胶质细胞产生并特异性地利用，因此NGF被认为在血多疾病的过程中具有关键性的保护作用。这篇综述将讨论NGF在视神经截断、缺血性损伤、眼高压以及青光眼等疾病中对视网膜神经节细胞（RGCs）的作用。
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脑组织NOS的表达和急性高眼压诱导的视网膜缺血再灌注损伤研究进展
青光眼时眼压升高能造成视网膜缺血性损害,其中一氧化氮(NO)的作用愈来愈受到关注.NO作为一种可扩散的化学信使,在调节神经传导,血管舒张,神经性细胞毒性等方面有重要作用.近年的研究表明,急性青光眼致视网膜缺血再灌注损伤会向中枢视觉系统发展[1].近20年来人们普遍采用视网膜神经节细胞和中枢视觉系统作为体内外研究中枢神经系统损伤与再生的模型[2].在猴实验性青光眼模型中发现,随着视神经的变性损伤,外侧膝状体的神经元会发生不同程度的萎缩,且与视神经纤维的丧失程度[3]和眼压升高程度[4]有关.Lam等[5]在猕猴的青光眼模型中,发现视皮质的神经化学物质重新分布.Imamura等[6]通过对外侧膝状体和视皮质的研究,发现某种可塑性机制可能在这两个层面弥补着急性青光眼视网膜功能的变化.
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配对免疫球蛋白样受体B对体外视网膜神经节细胞生长的调控研究
目的 研究配对免疫球蛋白样受体B(paired immunoglobulin-like receptor B,PirB)对体外视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)生长的影响. 方法 分离野生型C57B J/6小鼠的RGCs,免疫荧光检测RGCs中PirB的表达情况,荧光定量PCR和Western blot方法检测培养1,3,5,7,9d时PirB在RGCs中的表达水平,并将培养的原代RGCs分为对照组(对RGCs不加处理)、慢病毒转染干扰PirB组(A组)、慢病毒转染干扰NgR组(B组)、慢病毒转染干扰PirB且联用睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)组(C组)、慢病毒转染干扰NgR且联用CNTF组(D组)和仅CNTF处理组(E组).使用MTT法及从形态学方面观察RGCs的生长发育情况. 结果 免疫荧光确定PirB在RGCs中表达,其mRNA和蛋白水平随时间呈现先升高后下降的变化,分别于培养5d和7d时达高水平.A组和B组PirB或NgR的表达降低,A组RGCs的生长状态较对照组旺盛:3d时为(40.2±5.3)μm:(29.1±3.8)μm,5d时为(72.2±4.2)μm:(52.3±8.2)μm(P ＜0.05);B组、D组和E组与对照组比较、C组与A组比较,RGCs的生长状态差异均无统计学意义(P均＞0.05). 结论 阻断PirB可明显改善RGCs的生长状态,为临床治疗视神经损伤提供了新的思路.
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睫状神经营养因子对大鼠视网膜神经节细胞bcl-2表达的影响
目的 观察睫状神经营养因子(CNTF)对培养的大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)bcl-2表达的影响. 方法 取出生后2～3 d Wistar大鼠视网膜组织行RGCs培养,Thy-1单克隆抗体免疫细胞化学鉴定RGCs.实验分2组,对照组单纯加入DMEM,CNTF组加入浓度为20 ng/ml的CNTF.RGCs培养3 d后CNTF组和对照组分别行Western blot检测RGCs内bcl-2蛋白的表达. 结果 Thy-1单克隆抗体免疫细胞化学检查显示,培养3 d的RGCs胞膜和轴突呈棕黄色,且90%以上为免疫阳性细胞.CNTF组RGCs内bcl-2蛋白表达高于对照组(P＜0.05). 结论 CNTF对神经节细胞的营养作用可能与bcl-2基因表达增高有关.
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玻璃体注射α-晶体蛋白对视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用
目的 在体观察α-晶体蛋白对LongEvens大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞(RGCs)存活的保护作用. 方法 于视神经损伤前7 d经上丘及外侧膝状体逆行标记RGCs.成年LongEvens大鼠35只,其中10只用于提取α-晶体蛋白,另外25只分成5组,分别为正常对照组和伤后1,2,3,4周组,每组5只.右眼经玻璃体腔注射浓度为1×10-5g/L的α-晶体蛋白5 μl,左眼注射牛血清白蛋白5 μl,分别于伤后1,2,3,4周对实验大鼠行RGCs计数. 结果 视神经夹伤后1周RGCs数明显下降,牛血清白蛋白组下降为正常值的33%;视神经夹伤后2周下降为正常值的4%,3周时下降为正常值的3%, 4周时下降为正常值的1%.玻璃体腔注射α-晶体蛋白组在视神经夹伤后1周RGCs数下降为正常值的51%;2周时RGCs数下降为正常值的11%;3周时RGCs数下降为正常值的7%,4周时下降为正常值的3%,均显著高于对照组(P＜0.01). 结论 视神经损伤后玻璃体腔注射可溶性α-晶体蛋白能够延缓RGCs死亡,具有一定的保护作用.
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混合晶状体蛋白对大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用
目的 观察混合晶状体蛋白对Long Evens大鼠视神经切断伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)存活的作用.方法 于视神经切断伤前7 d逆行标记RGCs.将成年Long Evens大鼠20只,随机分成4组,分别为正常对照组和视神经切断伤后l,2,3周组,每组5只.视神经切断后即刻右眼经玻璃体腔注射浓度为1×10-4g/L的混合晶状体蛋白5μl(实验眼),左眼注射等渗盐水5μl(对照眼),分别于伤后1,2,3周对实验动物行RGC计数.结果 视神经切断伤后1周RGCs数明显下降.混合晶状体蛋白作用眼RGCs数在视神经切断伤后1、2、3周分别下降为正常对照组的71%、32%和15%,但均显著高于参渗盐水作用眼(P＜0.01).结论 视神经切断伤后玻璃体腔注射可溶性混合晶状体蛋白能够保护RGCs,延缓其死亡,这种作用可以持续到视神经切断伤3周以后.
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谷氨酸在大鼠冲击伤复合缺氧后视网膜神经节细胞损伤中的作用
目的研究谷氨酸在大鼠冲击伤复合缺氧后视网膜神经节细胞(RGCs)损伤中的作用及机制. 方法健康Wistar大鼠56只,分为正常对照组(NG,6只)、单纯冲击伤组(BG,24只)、冲击伤复合缺氧组(HG,24只).致伤组动物用BST-Ⅰ型生物激波管致冲击伤.HG组致伤后置于体积分数为12.5%低氧舱内6 h.于伤后1,3,5,7 d处死大鼠取视网膜采用氨基酸分析仪测定其谷氨酸浓度,用免疫组化方法检测Caspase-3P20表达,TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)染色观察凋亡情况. 结果伤前视网膜谷氨酸浓度为(0.245±0.008) μg/mg,伤后1 d 谷氨酸浓度即明显升高(P＜0.01),以后逐渐回落,但仍明显高于正常(P＜0.01).正常视网膜内未见Caspase-3P20表达和TUNEL染色阳性细胞,伤后3 d开始出现,5 d明显增多(P＜0.01),7 d仍维持于高水平,且阳性细胞主要为RGCs,内核层偶见.所检测三个指标变化呈显著性相关. 结论冲击伤复合缺氧明显加重了视网膜的损伤,谷氨酸兴奋毒性介导的RGCs凋亡可能是冲击伤复合缺氧后视网膜损伤的重要机制之一.
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晶体蛋白对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞的作用
目的研究晶体蛋白能否促进离体培养的视网膜神经节细胞(RGCs)存活和生长,初步探讨损伤晶状体促进RGCs的存活和轴突再生的确切作用物质. 方法分别用晶体蛋白、晶体蛋白激活的巨噬细胞培养液及DMEM对RGCs进行培养,观察RGCs在体外存活时间,测量培养1,3,5 d有突起RGCs数、长突起长度及细胞活性,进行组间比较. 结果 (1)晶体蛋白组细胞能存活12～14 d,较其他两组显著延长(P＜0.05).(2)培养1,3,5 d,各实验组有突起的RGCs数均明显多于对照组(P＜0.01),晶体蛋白组有突起的RGCs数较其激活的巨噬细胞培养液组明显增多(P＜0.01).(3)培养1,3,5 d,各实验组RGCs长突起长度均较对照组显著延长(P＜0.01),且晶体蛋白组与其激活的巨噬细胞培养液组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).(4)培养3 d和5 d时,晶体蛋白组细胞活性显著高于对照组 (P<0.01). 结论 (1)晶体蛋白对离体培养的RGCs存活和生长具有显著的直接促进作用;(2)晶体蛋白也可通过激活巨噬细胞间接发挥作用,但以直接作用为主.
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大鼠视神经不同程度量化损伤模型的建立和评价
目的建立一种标准化的大鼠视神经不同程度部分损伤动物模型,对致伤强度和损伤程度以及它们之间的关系进行量化分析. 方法用压力为148.0 g的反向镊夹持大鼠视神经 3,6,12,30,60 s,或用压力为32.4 g的微型动脉夹夹持大鼠视神经 5,10,15 s,建立不同程度视神经损伤的动物模型,用经颅荧光金逆行标记视网膜节细胞(retinal ganglion cell, RGC)的方法,观察损伤后1个月RGC的变化,以RGC数目的变化衡量损伤程度,并用坚牢蓝经心脏灌注的方法,评价该致伤模型中眼部血供的变化. 结果用致伤冲量和平均冲量能全面地反映致伤强度,荧光金逆行标记RGC计数是衡量损伤程度的良好指标.微型动脉夹夹持大鼠视神经 15 s与反向镊夹持3 s的平均致伤冲量相等,引起的RGC数目的变化也相似.随着致伤强度的增加,RGC数目减少,RGC的数目与致伤冲量之间呈幂函数曲线关系.短时间的视神经夹持不会引起视网膜的缺血损伤. 结论利用反向镊夹持的方法可以很简便地建立一种易于标准化的视神经部分损伤模型,该模型可以用冲量、平均冲量和RGC计数的方法来评价.
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视神经损伤后睫状神经营养因子受体的表达变化
视神经创伤、青光眼等疾患主要影响视网膜神经节细胞( RGCs),RGCs的死亡是视功能发生不可逆性改变的直接原因,因此,关于RGCs存活和再生的研究一直倍受眼科界关注.近十年来的研究发现,睫状神经营养因子(CNTF)能明显促进RGCs的存活和再生[1,2].睫状神经营养因子受体(CNTFR)是CNTF的特异性结合蛋白,它的表达变化与CNTF的作用密切相关.为进一步了解CNTFR mRNA在视神经损伤及修复过程中的表达情况,笔者应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对其进行了半定量研究.
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晶状体蛋白促大鼠视网膜神经节细胞存活和突起生长的体外研究
目的 探讨晶状体内各主要可溶性晶状体蛋白对离体培养的大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)存活和突起生长的作用,为视神经损伤后再生的研究提供新的思路. 方法 采用分子排阻凝胶色谱法分离纯化晶状体中各主要可溶性晶状体蛋白——α、β-H、β-L、γ晶状体蛋白,再通过SDS-PAGE电泳、肽质量指纹图谱方法鉴定其为目的 蛋白质后,按组分别进行RGCs离体培养试验,观察RGCs的长突起长度和存活细胞数. 结果 RGCs的长突起长度6 d时达大值,分别为:对照组(92.27±35.93)μm,α晶状体蛋白组(181.59±43.78)μm,β-H晶状体蛋白组(123.33±52.81)μm,β-L晶状体蛋白组(89.55±22.40)μm,γ晶状体蛋白组(86.01±39.15)μm.6 d时,各组RGCs存活细胞数分别为:对照组(9.80±3.25)个/视野,α晶状体蛋白组(13.00±4.25)个/视野,β-H晶状体蛋白组(11.33±6.28)个/视野,β-L晶状体蛋白组(8.10±1.83)个/视野,γ晶状体蛋白组(5.74±2.82)个/视野.α、β-H晶状体蛋白组RGCs的长突起长度和存活细胞数明显高于对照组,α晶状体蛋白组作用更明显,β-L晶状体蛋白组与对照组比较,差异无统计学意义,γ晶状体蛋白组存活细胞数在6 d时明显少于对照组. 结论 α晶状体蛋白有明显的促进体外培养的RGCs存活和突起生长的作用,是一种晶状体源性神经保护物质.β-H晶状体蛋白也有一定的促RGCs突起生长和保护存活的作用.γ晶状体蛋白有一定的抑制RGCs存活的作用.
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α晶体蛋白与视网膜神经节细胞结合的细胞定位研究
目的 对α-晶体蛋白与视网膜神经节细胞(RGCs)之间的作用进行定位研究.方法 原代培养RGCs,Thy1.1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测,将α-晶体蛋白与RGCs共孵育,应用免疫细胞化学方法, 对α-晶体蛋白在RGCs上的靶分子进行间接免疫标记,再以光镜、激光共聚焦显微镜和电镜观察标记物,对α-晶体蛋白与RGCs的结合进行亚细胞定位.结果 Thy1.1鉴定RGCs纯度为90%～95%.RGCs免疫组化染色结果显示,α-晶体蛋白与其靶分子结合复合物在RGCs膜上呈阳性表达;共聚焦显微镜下发现RGCs有免疫荧光复合物沉积,大量呈"戒指"状分布于细胞膜,少量分布于细胞轴突上.电镜结果显示,RGCs上有免疫复合物沉积,呈"线状"分布在细胞膜上,对照组呈阴性.结论 α-晶体蛋白能与RGCs发生结合,其作用靶点在RGCs膜上.α-晶体蛋白与RGCs的结合不是吸附作用,但是否为受体-配体性质的结合还需进一步验证.
