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人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析
目的 在大肠杆菌中表达抗人TNF-α单链抗体(ScFv),并分析 它的结合活性和中和活性. 方法 在获 得抗人TNF-α E6ScFv的基础上,用热诱导载体pBV220在大肠杆菌中表达E6ScFv蛋白. ELIS A测定抗体的结合活性,实时BIA技术确定亲和常数,L929 细胞毒试验分析其中和活性. 结果 克隆了抗人TNF-α E6ScFv基因的热 诱导载体pBV220在大 肠杆菌中,经42℃热诱导,得到了相对分子质量(Mr)约为27 000的重组蛋白质,表达 量占菌体 总蛋白的18%. 对在大肠杆菌中表达的E6ScFv进行了复性和亲和层析纯化,并进一步证实: ①E6ScFv具有与hTNF-α结合的活性,其结合表位与亲本抗E6单克隆抗体(mAb)相同;②E6S cFv与hTNF-α的亲和常数为3.71×104 M-1;③E6ScFv具有中和hTNF-α细胞毒作 用的活性. 结论 以上结果有助于ScFv拮抗TNF-α的治疗.
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汉滩病毒M,S基因部分片段在大肠杆菌中的融合表达
目的 在大肠杆菌中融合表达含主要抗原位点的汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与NP片段. 方法 将汉滩病毒76-118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5′端约0.7 kb的片段连接,克隆入pGEX-4T2,构建嵌合基因原核表达载体pGEX-4T2-G1S0.7,并在大肠杆菌XL1-Blue中,诱导GST-G1S0.7融合蛋白的表达. 表达产物用ELISA和Western blot进行鉴定. 结果 成功地构建了嵌合原核表达载体pGEX-4T2-G1S0.7. 经IPTG诱导后,ELISA活性测定结果表明,该融合蛋白可与抗汉滩病毒NP及糖蛋白的mAb特异性结合. Western blot结果显示,诱导出相对分子质量 (Mr)大于1×105的G1S0.7与GST的融合蛋白. 结论 获得具有特异性结 合活性的融合蛋白GST-G1S0.7,为汉滩病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础.(潘伯荣)
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白蛋白在烧伤治疗中的应用进展
人体白蛋白(human albumin,HA)是由585个氨基酸残基组成的非糖基化球状血清蛋白,是一种中等相对分子质量(65×103)的胶体,在肝脏中合成[1].HA占血管内蛋白量的一半,是血清中含量丰富的蛋白质,人体血浆胶体渗透压(COP)的75%~80%取决于HA浓度[2].
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百令胶囊中醇溶性蛋白质类成分的提取分离、相对分子质量确定及生物活性筛选
目的:提取分离百令胶囊中的醇溶性蛋白质类成分,并进行相对分子质量确定和初步生物活性筛选.方法:采用水提醇沉法提取蛋白质类成分,HPGFC分离,再用Tricine-SDS-PAGE电泳法测定相对分子质量,后用表达谱基因芯片技术初步筛选醇溶性蛋白质类成分的牛物活性.结果:提取分离得到百令胶囊中2段醇溶性的蛋白质类组分,其中蛋白质类组分Ⅰ包含2种不同的蛋白,相对分子质茸约为3.4×104与2.2×104;蛋白质类组分Ⅱ中包含3种不同的蛋白,其相对分子质量约为3.2×104,3×104,2.5×104.表达谱基因芯片显示该2段醇溶性蛋白质类成分引起肾293细胞基因表达的不同.结论:所分离得到的醇溶性蛋白质类成分对肾293细胞的基因表达有影响.
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羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液相对分子质量及分布的测定
目的:建立凝胶色谱法由多角度激光光散射检测器和示差折光检测器联用测定羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液相对分子质量及分布的方法.方法:以醋酸盐缓冲液(醋酸钠18.7 g,冰醋酸34.5 mL,加水溶解并稀释至5 L)为流动相,流速0.5 mL·min-1,TSK-GEL G4000 PWXL色谱柱,多角度激光光散射检测器和示差折光检测器联用;SPSS软件进行系统聚类分析.结果:获得了样品的重均相对分子质量、数均相对分子质量、相对分子质分布、聚集态等数据;分析了 17个不同来源样品,所分析样品大致可分为2类.结论:本方法快速、简便,结果准确,适于该产品相对分子质量及分布的测定;目前,市售的羟乙基淀粉130注射液的相对分子质量及相对分子质量分布差异较大,有待于进一步规范.
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不同色谱柱和GPC软件对灰树花倍他葡聚糖相对分子质量测定的影响
目的:考察不同的色谱柱和GPC软件对灰树花倍他葡聚糖相对分子质量(Mr)测定的影响.方法:分别采用TSKG4000PWXL和Shodex OHpak SB-804HQ色谱柱按高效凝胶渗透色谱法对灰树花倍他葡聚糖的Mr进行测定,再分别采用安捷伦公司、岛津公司、龙智达公司和千谱公司的GPC专用软件进行计算,并对各Mr计算结果进行比较.结果:采用TSKG4000PWXL和Shodex OHpak SB-804HQ色谱柱测定灰树花倍他葡聚糖的Mr结果有明显差异,其重均相对分子质量(Mw)相差>10%,峰位相对分子质量(Mp)相差>20%,但Mr的分布宽度(D)无明显差异;采用4种不同公司的GPC软件进行计算的Mr结果相差较小,其相对偏差<3%.结论:不同的色谱柱对灰树花倍他葡聚糖Mr的测定结果有明显影响,但不同GPC软件对Mr的测定结果影响较小.
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国产与进口低分子肝素相对分子质量及其分布比较研究
目的:考察国产低分子肝素的相对分子质量及其分布情况,并与进口低分子肝素比较,为制订该品种国家标准提供依据.方法:高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法,色谱柱:TSK-GEL G3000SW(7.5 mm×30 cm,10μm);柱温:35℃;流动相:2.84%硫酸钠水溶液(pH5.0);检测波长:234 nm;流速:0.5 mL·min-1.结果:测得国内外15个厂家共124批低分子肝素样品的相对分子质量及其分布情况.结论:大部分国内产品能符合BP 2003版对低分子肝素的相对分子质量的要求,但国内产品的相对分子质量分布整体较国外产品宽.
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高效凝胶渗透色谱法测定邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素酯的相对分子质量及其分布
目的:建立一种邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素酯的相对分子质量的质控方法.方法:采用高效凝胶渗透色谱法(HPG-PC),色谱柱为Styrage~(R) Waters-HR4(7.8 mm×300 mm),以已知分子量的聚苯乙烯为标样,四氢呋喃为流动相;柱温40℃;流速1.0 mL·min~(-1);示差折光检测器.结果:利用GPC软件处理得到邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素酯的重均分子量,分子量分布和分布系数.结论:本文所建立HPGPC方法简便快速,重复性好(RSD<2%),适合于该类药物的质量控制.
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一种重组戊型肝炎疫苗抗原的一级结构分析
目的:对一种重组戊型肝炎疫苗抗原的一级结构进行分析.方法:采用液质联用的方法测定其相对分子质量;采用变性剂使重组戊肝疫苗抗原的空间结构充分打开,用胰蛋白酶对其进行酶解,液质联用测定酶解后样品的液质肽图;结合质谱相对分子质量的测定及液质肽图的解析对其一级结构进行分析.结果:该抗原的氨基酸序列与理论一致,部分蛋白的N-末端缬氨酸存在乙酰化修饰,修饰率约为40%;链内唯一1个半胱氨酸处于还原状态,未参与链间二硫键的形成.结论:采用合适的酶解方法结合液质联用技术,对该疫苗抗原的氨基酸序列进行了确证,并对翻译后修饰进行了鉴定,所用方法可为其他重组疫苗抗原的一级结构分析提供参考.
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低分子肝素相对分子质量测定用对照品的研制
目的:制备类似WHO的附带一宽分布标样表的低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)相对分子质量测定用对照品.方法:采用肝素酶Ⅰ控制降解肝素得到宽分布低分子的肝素片段混合物,并以WHO LMWH相对分子质量对照品为对照,采用高效分子排阻色谱法绘制自制相对分子质量与累积面积百分比的量表.分别利用该自制对照品与WHO对照品检测4种不同工艺制备的LMWH相对分子质量.结果:自制LMWH相对分子质量对照品与WHO相对分子质量对照品的校正曲线基本重合在一起,2种对照品测定的4种LMWH相对分子质量结果十分接近.结论:自制的LMWH相对分子质量测定用对照品可以用于LMWH相对分子质量的测定,为LMWH相对分子质量测定用对照品国产化奠定了基础.
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右旋糖酐铁相对分子质量及其分布的探析
目的:对右旋糖酐铁原料及其制剂的相对分子质量与相对分子质量分布进行研究.方法:采用凝胶液相色谱法,示差检测器,Shodex SB-806M HQ(7.8 mm× 300 mm)凝胶柱,以0.1%叠氮化钠溶液为流动相对7个厂家生产的12批样品进行分析.结果:各企业生产的右旋糖酐铁原料及其制剂的右旋糖酐铁相对分子质量与相对分子质量分布测定结果差异较大,且同一企业的原料与制剂测定结果也不一致.结论:各企业产品质量有待进一步提高,建议对现行质量标准增加右旋糖酐铁相对分子质量与相对分子质量分布的测定.本文为全面评价右旋糖酐铁的质量和完善其质量标准提供借鉴和参考.
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中药多糖有效部位研究中相对分子质量及分布研究相关问题探讨
本文结合审评中发现的问题,对相对分子质量及其分布测定在中药多糖有效部位研究中的重要作用及应关注的问题进行了分析,建议采用HPGPC方法进行测定,并与文献及其他方法进行比较研究,相互印证结果.
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液质联用鉴定重组人血管内皮抑制素
目的:用液质联用技术鉴定重组人血管内皮抑制素(rhEndostatin).方法:利用ESI-Q-TOF-MS法测定rhEndostatin的精确相对分子质量,通过HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法测定其胰蛋白酶酶切后肽段的部分氨基酸序列并结合数据库检索进行结构鉴定.结果:重组人血管内皮抑制素的实测相对分子质量为21114.5,与理论相对分子质量21113.8相比非常接近.HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS测定m/z 802.0的肽段的部分氨基酸序列为Ala-Pro-Ser-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu.将其m/z和氨基酸序列在MASCOT数据库检索,结果表明重组人血管内皮抑制素的结构正确.结论:液质联用是鉴定蛋白质的灵敏、快速、准确的新方法.
关键词: 液质联用 重组人血管内皮抑制素 相对分子质量 氨基酸序列 -
蕨菜多糖的分离纯化单糖组分及免疫调节活性研究
目的:从蕨菜中分离纯化多糖成分,并进行相对分子质量、单糖组成和免疫调节活性研究.方法:采用热水浸提法提取蕨菜粗多糖,再经脱蛋白、DEAE Sepharose Fast Flow和Sepharose 4B凝胶柱层析得到3种均一多糖组分PLP1、PLP2和PLP3;采用高效液相凝胶渗透色谱法测定均一多糖相对分子质量;采用气相色谱分析均一多糖的单糖组分,采用MTT法和Griess法检测多糖对RAW264.7细胞生长和释放NO能力的影响.结果:PLP1、PLP2和PLP3的相对分子质量分别为6.62×104、4.34×105、1.88×105;PLP1含有鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,PLP2含有鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖和半乳糖,PLP3合有鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖和半乳糖.3种多糖均可显著促进RAW264.7细胞的增殖,均具有显著增强RAW264.7细胞释放NO的能力,并呈一定的剂量效应关系.结论:PLP1、PLP2和PLP3 3个组分均为新的天然来源的均一杂多糖.3种多糖体外均能激活巨噬细胞,呈现显著的免疫调节活性.
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相对分子质量测定作为单抗药物常规放行分析方法的可行性商榷
目的:探讨十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)作为单克隆抗体常规放行分析方法的适用性.方法:对5种国产单克隆抗体药物进行SDS-PAGE法测定相对分子质量,并与质谱法测得的精确相对分子质量进行比较.结果:SDS-PAGE法测定时,采用不同的marker和不同的拟合方程,得出的相对分子质量具有较大的差异,并且与质谱法测得的精确相对分子质量具有一定的差异.结论:运用SDS-PAGE测定相对分子质量作为单抗的常规放行分析方法值得进一步商榷,应用质谱法在前期产品开发和质量控制过程对精确相对分子质量进行跟踪检测具有更准确的特点.
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毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒原液的纯度
目的:建立毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒原液的纯度.方法:采用50 μm×57 cm(有效长度50cm)无涂层毛细管.进样时方法设置为:进样5 kV,20 s;分离电压为15 kV,维持30 min,两端加压138 kPa;温度:25 ℃;检测波长:220 nm.结果:毛细管电泳法测定重组人乳头瘤病毒(HPV) 16型、18型原液主峰分离度分别为2.4和3.0,HPV 16L1和HPV 18L1原液在浓度为0.125 ~0.750 mg·mL-1时线性关系良好(HPV 16L1,r =0.9836;HPV 18L1,r =0.9931).HPV 16L1和HPV 18L1原液的精密度和稳定性试验的RSD均<2.0%.结论:本文建立的方法可用于重组人乳头瘤病毒原液的纯度检测.
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Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原
①目的初步确定风疹病毒(RV)特异性抗原的相对分子质量,为RV特异性抗原的进一步纯化奠定基础.②方法从RV感染人的胚肺成纤维细胞中粗提蛋白,应用RV标准血清,以免疫印迹法鉴定特异性RV抗原,并参照蛋白分子质量Marker,初步确定其相对分子质量.③结果在相对分子质量为59 000,42 000~51 000,34 000,17 000的位置出现几条特异性显色带,其中以相对分子质量为34 000及17 000左右的条带显色较深. ④结论 RV特异性细胞工程抗原的相对分子质量主要在34 000及17 000左右.
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百草枯中毒诊治进展
百草枯(Paraquat,PQ),化学名称是1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐,由英国卜内门化学公司研发,相对分子质量186.3,白色结晶,以阳离子形式存在.易溶于水,微溶于乙醇,几乎不溶于大多数有机溶剂,300℃左右分解,在中性和酸性介质中稳定,在碱性介质中迅速水解,在水溶液、紫外线照射下发生光分解.具有触杀作用和一定内吸作用,能迅速被植物绿色组织吸收,使其枯死,是一种快速灭生性除草剂.常用剂型为20%的墨绿色水溶制剂,1962年开始作为农药应用于农业,1964年爱尔兰报道了第1例百草枯中毒事件,此后自服及误服中毒报道逐渐增多.生产或使用不当可经消化道、呼吸道吸入及皮肤吸收引起中毒,一般认为口服20%原液10~20mL即可致死,口服20%原液者病死率高达60%~80%[1].国外报道百草枯中毒死亡率为33%~78%[2].
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含氢液(氢气)用于器官功能保护的研究进展
氢是自然界轻、含量丰富的元素,氢通过核聚变产生氦为太阳提供能源.氢气无色、无嗅、无味、高度易燃,是相对分子质量小的双原子气体.氢气在空气和纯氧中的安全浓度分别是<4.6%和<4.1%.在潜水医学领域中,氢气首先用于预防减压病[1].一直以来,氢气被认为是生理惰性气体.然而自2007年Ohsawa等[2]发现氢气具有抗氧化和抗凋亡特性,可选择性中和羟自由基(·OH)改善脑缺血/再灌注损伤(IRI)和卒中,掀起了氢气治疗疾病的研究热潮.