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有血清和无血清培养人表皮干细胞的比较研究
1 对象与方法1.1 主要试剂Ⅱ型dispase酶、角质形成细胞无血清培养液(K-SFM)、胎牛血清(FCS)、DMEM无血清培养液、牛垂体提取物(BPE)均购自美国Gibco公司,人胎盘Ⅳ型胶原购自美国Sigma公司,角蛋白19(K19)单克隆抗体为福州迈新生物技术开发有限公司产品,整合素β1多克隆抗体购自美国Oncogene公司,Envision试剂盒由丹麦DAKO公司提供.
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黄芩苷完全抗原的合成鉴定及其多克隆抗体的制备
目的:研究黄芩苷作为一种半抗原分子,通过与载体蛋白偶联形成完全抗原后,使免疫动物血清中产生特异性抗体的可能性,为进一步建立黄芩苷的免疫分析测定方法提供实验依据.方法:采用活性酯法将黄芩苷(BAL)与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备黄芩苷完全抗原(BAL - BSA),并采用红外吸收光谱法、SDS - PAGE法、MALDI - TOF - MS法对其进行鉴定.用此完全抗原免疫动物制备抗血清,通过间接ELISA法检测其抗体效价.结果:完全抗原BAL - BSA中BAL与BSA的偶联比为3:1；用此完全抗原免疫的家兔产生针对BAL的多克隆抗体,抗体效价高可达1:8000.结论:成功合成了BAL的完全抗原BAL - BSA,且该抗原具有良好的反应原性与免疫原性.
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溶脲脲原体蛋白UreG抗体对小鼠体外受精的影响
目的:探索与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白UreG抗体对小鼠体外受精的影响.方法:提取溶脲脲原体总DNA,用自行设计的引物扩增UreG全序列,PCR产物经TA克隆后,用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,克隆到表达载体pET-28a(+)中.在E.coliBL 21中,异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达His融合蛋白.用亲和层析纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获取多克隆抗体.观察该抗体对小鼠体外受精的影响.结果:对表达重组蛋白的质粒进行DNA测序以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,证实获取了目的蛋白.ELISA检测证实,免疫小鼠产生了高效价的抗体.该抗体能够抑制小鼠精卵的融合.结论:与人精子膜存在交叉反应的溶脲脲原体蛋白UreG抗体,可导致小鼠精卵结合率降低.
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抗人CD4单克隆抗体制备及其抗HIV-1功能鉴定
目的 制备具有抗HIV-1功能的抗人CD4单克隆抗体.方法 构建人CD4真核表达质粒pcDNA3.1-hCD4,将该质粒DNA免疫BALB/c小鼠.免疫前血清作为阴性对照,通过HIV-1假病毒中和实验和ELISA方法检测多克隆抗体血清.通过杂交瘤技术制备鼠抗CD4单克隆抗体,HIV-1假病毒中和实验进行筛选.通过不同亚型假病毒中和实验和CD4 D1D2蛋白ELISA方法分别检测腹水纯化单克隆抗体的中和活性和特异性结合力.结果 DNA免疫后第6周的多抗血清100倍稀释后对HIV-1假病毒的抑制率可达75％,第8周其抑制率可上升至95％.CD4 D1D2蛋白ELISA结果显示,免疫后第4周多抗血清就显示出同CD4蛋白较强的特异性结合.共获得160余株对HIV-1假病毒B’、BC、AE亚型具有中和活性的单克隆抗体.选择其中中和活性较高的8株制备纯化腹水单抗,其中5株单抗IC50小于130 μg/ml.ELISA检测结果显示腹水纯化单抗与CD4 D1D2蛋白可以特异性结合.结论 获得了具有抗HIV-1假病毒的抗CD4单克隆抗体.具有HIV-1广谱中和活性的抗CD4抗体可用于研发有效的被动免疫制剂,控制艾滋病传播.
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岩沙海葵毒素直接酶联免疫吸附检测方法的研究
[目的]制备岩沙海葵毒素(PTX)多抗血清,纯化并标记辣根过氧化物酶,建立PTX多克隆直接酶联免疫吸附检测方法.[方法]将纯品毒素PTX与大分子蛋白质匙眼血蓝蛋白(KLH)分别巯基化,用化学法偶联二者成为半抗原,以其诱导BALB/c小鼠产生多价抗血清;以辣根过氧化物酶(HRP)标记PTX多抗血清;以PTX纯毒素作为包被抗原,HRP标记的多价抗血清为酶标抗体,建立PTX多抗直接ELISA检测方法.[结果]制备的抗PTX多价抗血清,经纯化后与HRP标记成功;建立的PTX多抗直接ELISA检测法,其佳工作浓度为1:80.[结论]本研究制备的PTX人工免疫抗原具有较高的特异性和免疫原性,多克隆抗体为特异性抗PTX抗体,PTX多抗直接ELISA检测法对PTX的检测可达到5～10ug水平,该法应用于海产品中PTX快速检测的结果,待进一步研究.
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马铃薯V病毒抗体及TAS-ELISA试剂盒的研制
用纯化的马铃薯V病毒(PotatovirusV)免疫家兔获得多克隆抗体;免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤细胞技术获得2株分泌马铃薯V病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株并制备腹水抗体.以多克隆抗体为包被抗体,单克隆抗体为检测抗体研制了TAS-ELISA检测试剂盒.
关键词： 马铃薯V病毒 多克隆抗体 单克隆抗体 TAS-ELISA试剂盒 -
玉米褪绿斑驳病毒抗体及TAS-ELISA试剂盒的研制
将纯化的玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus）制剂免疫家兔，获得兔多克隆抗体；将纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤细胞技术获得1株分泌玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株并制备腹水抗体。研制了多克隆抗体为包被抗体，单克隆抗体为检测抗体的TAS-ELISA试剂盒。
关键词： 玉米褪绿斑驳病毒 多克隆抗体 单克隆抗体 TAS-ELISA试剂盒 -
烟草环斑病毒抗体及DAS-ELISA试剂盒的研制
将纯化的烟草环斑病毒免疫家兔获得多克隆抗体；免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤细胞技术获得1株分泌烟草环斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株并制备腹水抗体。以戊二醛为交联剂，采用两步法将烟草环斑病毒单克隆抗体用碱性磷酸酯酶标记，研制了烟草环斑病毒DAS-ELISA试剂盒。
关键词： 烟草环斑病毒 多克隆抗体 单克隆抗体 DAS-ELISA试剂盒 -
MMP-11多克隆抗体的制备及其法医学意义
目的 制备兔抗人基质金属蛋白酶-11(MMP-11)多克隆抗体,建立用MMP-11抗体检测月经血的可行方法,探讨其法医学意义.方法 将用基因工程制备的人MMP-11融合蛋白免疫新西兰白兔,饱和硫酸铵法进行抗体纯化.运用蛋白印迹法检测月经血痕、外周血痕、阴道液斑、精液斑、唾液斑和尿液斑,盲测验证该方法的可靠性.结果 高效价的兔抗人MMP-11多克隆抗体检测月经血MMP-11蛋白的阳性率为90.48%(93/105),而外周血痕、精液斑、唾液斑、尿液斑和阴道液斑均未检出MMP-11.结论 用自制的抗MMP-11多克隆抗体所建立的蛋白印迹法检测月经血中的MMP-11特异性好,灵敏有效,可用于月经血及外周血的鉴别.
关键词： 法医物证学 基质金属蛋白酶-11 多克隆抗体 月经血 -
兔抗吗啡多克隆抗体制备
先将吗啡在6-羟基位改造为6-琥珀酰吗啡,再通过碳二亚胺将其与牛血清白蛋白或卵蛋白胶连分别制备免疫原和检测原,免疫新西兰大白兔制备出高效价(1:12800)抗吗啡多克隆抗体,为进一步制备抗吗啡单克隆抗体奠定基础.
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SMCY性别特异融合抗原的克隆表达及其抗体制备
目的 利用蛋白检测的快速性优势,研究不同性别在SMCY抗原氨基酸序列的差异,筛选出特异性氨基酸序列,并克隆表达性别特异融合抗原,制备相应抗体,建立一种快速鉴别法医物证性别的方法.方法 通过对人SMCY和SMCX进行序列分析,发现了三段差异片段,采用搭桥PCR方法获得差异片段全长基因,连接入pET-28a载体进行原核表达,用Ni柱纯化后的性别特异融合抗原免疫制备多克隆抗体,用ELISA法和western blot检测SMCY多抗与抗原的反应特异性,制作胶体金试纸条检测样本.结果 筛选出具有性别特异性的氨基酸序列,获得SMCY性别特异融合抗原,成功制备出多克隆抗体及胶体金试纸条.结论 获得SMCY性别特异融合抗原具有很好的抗原活性,制备的多克隆抗体可以与抗原特异性地结合,用于性别鉴定.
关键词： 法医物证学 性别鉴定 SMCY性别特异融合抗原 克隆和表达 多克隆抗体 -
绿色荧光蛋白多克隆抗体的制备
背景与目的:制备绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠多克隆抗体.材料与方法:以GFP转基因小鼠肌肉为抗原,与免疫佐剂混匀后免疫同品系小鼠,4周后取血,以收集的血清做免疫细胞化学和免疫组织化学,Western blot分析.结果:收获的抗体在1∶200稀释度时能显示强阳性结果.结论:直接用GFP转基因小鼠肌肉为抗原可在较短时间内大量制备GFP多克隆抗体,并能对转染有GFP阳性细胞的肝组织取得良好的检测效果.
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免疫组织化学检测MMP-11鉴定月经血
目的 建立用自制兔抗人基质金属蛋白酶-11(matrix metalloproteinase-11,MMP-11)多克隆抗体鉴定月经血的免疫组化方法,探讨MMP-11蛋白酶的细胞定位.方法 运用链霉卵白素一碱性磷酸酶(SAP)免疫组化法检测人月经血及外周静脉血涂片、阴道液涂片、子宫内膜石蜡切片和陈旧月经血痕涂片中的MMP-11.结果 MMP-11存在于子宫内膜上皮细胞和间质细胞内;外周静脉血和阴道液涂片未见有MMP-11染色;陈旧月经血痕涂片罕见完整子宫内膜细胞,但能检测到微弱特异信号.结论 用自制抗MMP-11多克隆抗体采用免疫组化技术能有效地检测MMP-11,区分月经血和静脉血.
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小鼠 LIGHT 胞外段基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备
目的：PCR 扩增小鼠 LIGHT 胞外段基因（LIGHTECD），构建含 LIGHTECD的原核表达载体，诱导表达重组蛋白，并免疫新西兰兔，制备多克隆抗体。方法：提取小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中的总 mRNA，RT-PCR 技术扩增 LIGHTECD，克隆至原核表达质粒 pGEX-6P-2中，构建重组表达载体pGEX-6P-2-LIGHTECD。重组质粒进行 PCR 和基因测序鉴定后，转化大肠杆菌 XL-1 Blue，IPTG 诱导表达。融合蛋白纯化后纯化后免疫新西兰兔，ELISA 及Western- blot 分析兔血清中抗 LIGHTECD抗体的效价和特异性。结果：RT-PCR 扩增得到525 bp LIGHTECD目的片段；经 PCR 和测序鉴定，证明构建的重组质粒中插入的片段为 LIGHTECD基因，测序结果经 BLAST 分析，与 Genbank 上登录序列完全一致；经 IPTG 诱导，重组质粒表达一相对分子量（Mr）约为45kD 的目的蛋白条带。ELISA 检测免疫兔血清效价为1∶20000。结论：成功地克隆了小鼠 LIGHT 胞外段基因，并表达了相应可溶性蛋白，准备了高效价的兔抗 LIGHTECD多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。
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血清PIVKA-Ⅱ在肝细胞肝癌中的应用进展
我国肝细胞肝癌（HCC）占原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）的90%。目前常用甲胎蛋白（AFP）筛查及诊断肝细胞肝癌，但是对于AFP低浓度或阴性的患者容易造成漏诊。在欧洲AFP阴性率更高，包括肝内胆管癌、高分化和低分化的HCC或HCC已坏死液化者AFP水平均可出现不增高的情况[1]。异常凝血酶原与正常凝血酶原的区别在于其氨基酸特定位置上的谷氨酸残基未经羧基化。当肝细胞发生癌变时，内质网不能将PIVKA－Ⅱ羧化成有活性的正常凝血酶原，从而使血清PIVKA－Ⅱ水平升高。近来，已经进行的几项大规模的病例研究中发现在截断点为40 mAU/ml时， PIVKA-Ⅱ诊断HCC的敏感性[2]高于AFP，更高于血清高尔基体蛋白73（GP73）及癌胚抗原等[3,4]。自1984年,Liebman等[5]首次通过放射免疫法用PIVKA-Ⅱ的多克隆抗体（MU-3）测定了肝癌病人血清PIVKA-Ⅱ水平以来，目前多采用电化学发光免疫分析法（electrochemiluminescence analysis， ECLIA）测定血清MU-3抗体的含量，间接反映PIVKA-Ⅱ的水平。但迄今为止，在中国大陆地区关于患者血清PIVKA－Ⅱ在肝癌的临床诊疗中的应用尚未全面开展。
