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烟草环斑病毒IC-RT-Realtime PCR检测方法研究
本研究首次应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-Realtime PCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了抗原抗体特异性结合、核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有显著提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题.
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烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备
烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大.本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT PCR扩增得到长约1500bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构建了含TRSV cp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP.序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%～94.6%.将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的TRSV CP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa.以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应.
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烟草环斑病毒抗体及DAS-ELISA试剂盒的研制
将纯化的烟草环斑病毒免疫家兔获得多克隆抗体；免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤细胞技术获得1株分泌烟草环斑病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株并制备腹水抗体。以戊二醛为交联剂，采用两步法将烟草环斑病毒单克隆抗体用碱性磷酸酯酶标记，研制了烟草环斑病毒DAS-ELISA试剂盒。
关键词： 烟草环斑病毒 多克隆抗体 单克隆抗体 DAS-ELISA试剂盒 -
电化学酶联免疫分析法检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒
将酶联免疫吸附技术同电化学检测相结合的电化学酶联免疫分析法已成功应用于植物病毒的测定.以邻苯二胺(OPD)底物为例,将抗原直接包被法(DAC-ELISA)同线性扫描极谱法(LSV)相结合,检测烟草花叶病毒(TMV)的提纯液,检出限可达0.25ng/mL,TMV粗提液的高稀释比为1:102400;检测烟草环斑病毒(TRSV)提纯液,检出限为10ng/mL,粗提液的高稀释比为1:10000,该方法的灵敏度比DACELISA光度法提高了5倍以上.
