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黑素瘤相关抗原D4(MAGE-D4)多克隆抗体的制备和应用
目的 制备兔抗人黑素瘤相关抗原D4 (MAGE-D4)多克隆抗体,鉴定其免疫学特性,并进行初步应用.方法 对构建的pMAL-C2/MAGE-D4重组质粒进行原核表达及纯化,获得MBP/MAGE-D4融合蛋白,并以此蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体.抗体经蛋白A凝胶柱亲和层析法纯化后,通过SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA、Western blot法检测抗体的效价及特异性;免疫组织化学染色法检测肺癌组织中MAGE-D4的表达及定位.结果 获得纯度较高的抗MAGE-D4多克隆抗体,ELISA检测抗体的效价为1∶256 000,Western blot法分析显示MAGE-D4多克隆抗体可特异性识别MAGE-D4重组蛋白,免疫组织化学结果表明,该抗体能识别肺癌组织中的内源性MAGE-D4蛋白,表达的阳性率为69.6％(17/23).结论 制备的MAGE-D4多克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度.
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含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)多克隆抗体的制备
目的 原核表达并纯化小鼠源性含1型血小板结合蛋白基序的去整合素样金属蛋白酶2(ADAMTS2)蛋白的C段(1109-1213),制备兔抗ADAMTS2多克隆抗体.方法 以重组质粒pGEX-6p-1-ADAMTS2 (1109-1213)转化大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过亲和纯化,并且经质谱鉴定;以表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗ADAMTS2的多克隆抗体.ELISA检测抗体效价,Western blot法鉴定抗体特异性.结果 在大肠杆菌中表达出目的蛋白ADAMTS2,纯化后经质谱鉴定并免疫新西兰大白兔,成功获得抗血清.血清效价达到1:160000以上,且具有良好的特异性.结论 成功制备出效价高、特异性好的兔抗ADAMTS2抗体.
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5-氟尿嘧啶多克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备5-氟尿嘧啶(5-FU)免疫原并制备其多克隆抗体.方法 采用化学合成法对5-FU进行修饰制备5-氟尿嘧啶-1-基乙酸半抗原(5-FUAA),并经碳酰二亚胺盐法将其分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)连接以制备免疫原.采用5-FU与BSA结合的免疫原(5-FUAA-BSA)免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,5-FU与OVA结合物(5-FUAA-OVA)包被酶标板经间接ELISA检测抗血清效价,并采用ELISA与Western blot法检测抗血清的特异性.结果 成功合成半抗原5-FUAA,并分别制备5-FUAA-BSA和5-FUAA-OVA完全抗原.将5-FUAA-BSA免疫BALB/c小鼠制备的免疫血清效价达1:1 280 000,且该多克隆抗体能特异地结合5-FU半抗原.结论 成功制备了5-FU的多克隆抗体.
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犬博卡病毒结构基因VP2多克隆抗体的制备与应用
目的 构建犬博卡病毒(CBV)结构蛋白VP2的兔抗VP2多克隆抗体并进行特异性鉴定.方法 应用PCR方法扩增获得CBV结构蛋白VP2 C末端区域300个氨基酸所对应的基因片段.经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)-VP2,转化至E.coli BL21中,异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物SDS-PAGE分析鉴定;纯化融合蛋白后免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,检测抗体效价及特异性.结果 通过酶切和测序证实成功构建原核表达载体pET-32a(+)-VP2,转化后可以成功诱导并纯化出大小与预期一致的蛋白;制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1:6400000,Western blot法及免疫荧光染色鉴定抗体的特异性.结论 成功制备了抗CBV结构蛋白VP2的多克隆抗体.
关键词： 犬博卡病毒(CBV) 结构基因VP2 多克隆抗体 -
兔抗醛-酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)多克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备兔抗醛-酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法 应用逆转录PCR法扩增AKR1B10全基因,将扩增产物连接到原核表达载体pET-15b上,构建重组质粒pET-15b-AKR1B10,将其转化至大肠杆菌E.coli DH5α中.用异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,表达产物经SDS-PAGE分析鉴定出阳性者进行克隆,扩大培养,提取重组蛋白,用His-tag纯化柱纯化重组蛋白.将纯化的重组蛋白皮下注射到新西兰白兔,加强免疫得到抗血清.用AKR1B10重组蛋白制备抗体纯化柱,从抗血清中纯化出抗AKR1B10多克隆抗体,并进行SDS-PAGE、ELISA、Westem blot法鉴定.结果 成功构建了重组质粒pET-15b-AKR1B10,并获得高纯度的重组蛋白His-Tag-AKR1B10,制备的多克隆抗体相对特异性地识别AKR1B10.结论 兔抗AKR1B10多克隆抗体制备成功,特异性较好.
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结核分枝杆菌抗毒素higA的原核表达及多克隆抗体制备
目的 克隆编码结核分枝杆菌抗毒素基因higA并在大肠杆菌中表达,纯化higA蛋白后,制备兔抗higA的多克隆抗体.方法 利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higA基因;构建重组表达质粒pET-32a(+)-higA;筛选出阳性重组质粒后,转化大肠杆菌BL21,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western blot法鉴定目的蛋白的表达;以纯化的higA蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗higA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定.结果 成功扩增出了higA基因,克隆于载体pET-32a(+)质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后能成功诱导higA蛋白[相对分子质量(Mr)36 630]的表达;利用纯化的higA蛋白免疫新西兰大白兔后,能有效地刺激特异性higA抗体的产生,抗体的效价达到1∶3200以上.结论 成功在大肠杆菌中表达出higA蛋白,并制备出效价及特异性良好的兔抗higA多克隆抗体.
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甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)的CUB1、CUB2片段多克隆抗体的制备及鉴定
目的 原核表达甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP-2)的CUB1、CUB2功能区蛋白,制备其功能区蛋白的多克隆抗体并进行鉴定.方法 利用带有CUB1、CUB2基因片段的pGEX-6P-2原核载体诱导表达GST-CUB1和GST-CUB2融合蛋白并进行纯化,将纯化后的融合蛋白作为抗原,与Freund佐剂充分混合后免疫5周龄BALB/c雌性小鼠,制备多克隆抗体;应用Western blot法检测多克隆抗体特异性,应用ELISA检测多克隆抗体效价.结果 成功表达并纯化GST-CUB1和GST-CUB2蛋白;应用其作为抗原对小鼠进行免疫后,成功制备出与其相应的多克隆抗体,且特异性强,与其他蛋白无交叉反应;间接ELISA测得CUB1抗体效价大于1:32 000,CUB2抗体效价大于1:16000.结论 成功制备了特异性强,效价高的GST-CUB1和GST-CUB2蛋白多克隆抗体.
关键词： MASP-2 CUB1和CUB2功能区片段 蛋白原核表达 多克隆抗体 -
肿瘤相关抗原胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白3多克隆抗体的制备和鉴定
目的 构建胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IGF2 BP3)的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化IGF2BP3-His融合蛋白,制备和鉴定小鼠抗人IGF2BP3多克隆抗体.方法 用PCR方法扩增IGF2BP3基因,构建到pET-28a原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导IGF2BP3蛋白的表达.所获得的蛋白经镍柱亲和层析纯化,并用透析方法脱去尿素使蛋白复性,获得IGF2BP3原核表达蛋白.将制备的原核表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,再用ELISA、Western blot法、免疫组织化学法对抗体的反应性及特异性进行鉴定.结果 成功克隆出IGF2BP3基因,经测序与GenBank公布的序列一致;PCR酶切鉴定证实成功构建了pET-28a-IGF2 BP3原核表达载体;质粒在BL21(DE3)中成功表达出相对分子质量(Mr)为70 000左右的融合蛋白,纯化后经SDS-PAGE分析纯度在90％以上.ELISA确定抗体效价在1∶50 000以上,且Western blot法和免疫组织化学技术均证实多克隆抗体能特异性识别目的蛋白.结论 成功制备了特异性的小鼠抗人IGF2BP3的多克隆抗体.
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β2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用
目的 利用人工合成β2糖蛋白1(β2GP1)多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及致病性.方法 应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35 ～51位氨基酸的多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体,利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性.体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3 H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子(TF) mRNA和蛋白表达;Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65表达情况;体内实验采用C3H/HeN小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征(EAPS)模型,检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间(APTT).结果 化学合成β2GP1多肽的纯度为94％,达到免疫用抗原标准.偶联KLH后免疫新西兰大白兔,其抗血清效价大于1∶32 000.Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带,双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合.体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、NF-κB p65磷酸化,诱导细胞TF mRNA及蛋白表达.体内实验成功建立EAPS小鼠模型,小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200,APTT明显缩短.结论 所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子,能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应.
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果蝇再生蛋白(rgn)多克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备具有高度特异性的抗果蝇再生蛋白(rgn)的多克隆抗体.方法 利用PCR技术从果蝇W1118 cDNA中获得rgn基因片段,构建重组质粒;将其转入JM109(DE3)菌株中诱导rgn融合蛋白表达,再利用Ni-NTA superflow层析柱法将其纯化;经Western blot法检测后,利用制备的抗原免疫SD大鼠,从血清中获得高纯度的抗rgn多克隆抗体,利用Western blot法和免疫组织化学染色法对抗体特异性进行鉴定.结果 构建的pRSETA-rgn表达载体成功表达6×His-rgn蛋白,融合蛋白在大肠杆菌中大量表达并纯化后,作为抗原免疫SD大鼠,获得了抗rgn的多克隆抗体;免疫组织化学染色技术证实rgn定位在果蝇三龄幼虫血细胞的细胞质.结论 成功获得了特异性较高的大鼠抗rgn多克隆抗体.
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志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70 (DnaK)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价.方法 PCR扩增M90T中的基因dnaK插入到原核表达载体pET-24a中,获得pET24a-dnaK重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白DnaK-His.将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清.用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价.结果 重组质粒pET24a-dnaK在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达.用纯化的融合蛋白DnaK-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T DnaK蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验.结论 成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T DnaK蛋白的小鼠多克隆抗体.
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大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)多克隆抗体的制备及活性鉴定
目的 制备大鼠Toll样受体2胞外段(TLR2ex,405T-573Q)的多克隆抗体并鉴定其活性.方法 用反转录PCR从大鼠肝细胞中扩增长507个碱基的TLR2部分胞外段,并构建重组表达载体pET28a-TLR2ex.在大肠杆菌BL21(DE3)中表达TLR2ex-6×His融合蛋白,该蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体.ELISA鉴定抗血清的效价,Western blot法检测抗血清的特异性.结果 成功构建了原核表达载体pET28a-TLR2ex,并成功表达纯化了TLR2ex-6×His融合蛋白,将该蛋白免疫BALB/c小鼠后获得抗血清;Western blot法结果显示该血清可以特异性地检出E3大鼠脾组织TLR2蛋白,ELISA测定该多克隆抗体的效价可以达到1∶76 800.结论 成功制备了大鼠TLR2胞外段(405T-573Q)的多克隆抗体.
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疣鼻栖鸭恒定链(MDIi)多克隆抗体制备及鉴定
目的 制备抗疣鼻栖鸭恒定链(MDIi)多克隆抗体,鉴定其与组织抗原MDIi的反应性.方法 以PCR扩增获得MDIi序列构建原核表达载体pET-32a/MDIi,转化大肠杆菌进行表达;对表达产物鉴定后,免疫小鼠制备抗MDIi多克隆抗体;间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,间接ELISA检测抗体与疣鼻栖鸭组织MDIi的反应强度.结果 成功构建了pET-32a/MDIi原核表达载体,诱导表达了相对分子质量(M)约40 000的包涵体形式的MDIi重组蛋白,免疫小鼠获得效价为1∶128 000的特异性多克隆抗体,抗体与疣鼻栖鸭组织中的MDIi反应滴度为1∶32 000.结论 成功制备了高效价的特异性抗MDIi多克隆抗体,抗体与组织抗原有较强的免疫反应性.
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11型HPV E7蛋白的表达及其多克隆抗体的制备
目的 构建人11型乳头瘤病毒(HPV 11)E7蛋白的原核表达载体,表达纯化后制备抗HPV 11 E7蛋白的多克隆抗体.方法 构建pGEX-4T2-HPV11 E7原核表达载体,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白GST-HPV11 E7,纯化获取11型HPVE7蛋白.将HPV11 E7蛋白免疫新西兰大白兔获得抗HPV11E7的多克隆抗体,用蛋白G琼脂糖纯化获得IgG型多克隆抗体.Western blot法及免疫荧光染色检测该抗体的效价及特异性.结果 SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导6h后可表达出高水平可溶性GST-HPV11 E7融合蛋白.纯化后免疫新西兰大白兔获得抗HPV11 E7的血清,纯化获得了IgG型多克隆抗体.Western blot及免疫荧光染色结果显示,兔抗HPV11E7 IgG具有效价高和特异性强的特点.结论 成功表达了HPV11 E7蛋白并制备了效价较高、特异性较好的IgG型兔抗HPV11 E7蛋白多克隆抗体.
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福氏志贺菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备高效的福氏志贺菌5a M90T3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体,并对其特异性进行评价.方法 提取M90T的全基因组,采用PCR法扩增M90T中的基因gapA克隆到原核表达载体pET-24中,重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,条件优化后纯化GAPDH-His融合蛋白.以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体.Western blot法、ELISA鉴定获得的抗血清.结果 成功构建了原核表达载体pET24a-gapA,通过一系列诱导条件的优化,确定可溶性条件为30℃、1mmol/L IPTG诱导2h.用纯化的融合蛋白GAPDH-His作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot法、ELISA证明多克隆抗体制备成功.结论 成功制备了福氏志贺菌5a M90T特异性的小鼠多克隆抗体.
关键词： 福氏志贺菌5aM90T 3-磷酸甘油醛脱氢酶 多克隆抗体 -
鸡源性高迁移率族蛋白B1多克隆抗体的制备及应用
目的 制备针对鸡的高迁移率族蛋白B1(chHMGB1)特异性抗原亲和层析多克隆抗体,并进行初步应用.方法 反转录PCR扩增chHMGB1的全长编码基因,通过序列比对分析筛选一段特异性的多肽序列,偶联载体后作为抗原免疫新西兰兔,采集血清,通过蛋白A柱及多肽偶联的Seprose4B柱得到亲和层析纯化的多克隆抗体;并利用Western blot法、间接免疫荧光染色、免疫组化方法进行鉴定.结果 成功制备了抗chHMGB1特异性的多克隆抗体.各项实验结果表明该抗体能特异性的识别重组蛋白以及天然的chHMGB1蛋白.结论 成功制备了鸡源性高迁移率族蛋白B1亲和层析多克隆抗体.
关键词： 鸡源性高迁移率族蛋白B1 亲和层析 多克隆抗体 -
HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备
目的 制备人乳头瘤病毒(HPV) 16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体.方法 用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21 a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性.结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白.结论 成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体.
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B19和B21单倍型鸡NK细胞受体B-NK19和B-NK21的多克隆抗体制备及鉴定
目的 利用大肠杆菌系统表达对多种禽病存在敏感性差异的B19和B21单倍型鸡NK细胞抑制性受体B-NK基因,并制备其多克隆抗体.方法 分别提取B19和B21鸡外周血淋巴细胞总RNA,采用反转录PCR法扩增B-NK基因(分别命名为B-NK19和B-NK21),克隆至pET-30a原核表达载体中,经酶切和PCR鉴定构建重组质粒.转入到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE分析外源蛋白的表达.将含有与组氨酸(His)标签融合表达的外源蛋白胶条切下,多点皮下免疫新西兰兔,分别制备B-NK19和B-NK21特异性多克隆抗体.利用Western blot法鉴定其组织相容性复合体(MHC)单倍型特异性.结果 成功构建了原核表达重组质粒pET-B-NK19和pET-B-NK21,利用IPTG在37℃诱导4h后目的蛋白获得表达,免疫5次后收获兔多克隆抗体,Western blot表明B-NK19和B-NK21蛋白存在免疫学交叉反应和部分特异性.结论 对多种禽病具有敏感性差异的MHC单倍体型B19和B21鸡的NK细胞抑制性受体B-NK蛋白存在抗原反应交叉性,其多克隆抗体具有部分特异性.
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小鼠抗人前B细胞白血病同源盒基因3多克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备前B细胞白血病同源盒基因3(PBX3)多克隆抗体.方法 采用反转录PCR扩增PBX3基因区序列,并重组入原核表达载体pGEX-4T-1,重组载体转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-PBX3融合蛋白的表达.SDS-PAGE纯化融合蛋白,并用GST-PBX3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,收集经过免疫的小鼠血清即抗PBX3的多克隆抗血清,采用间接ELISA检测其效价,通过免疫细胞化学技术及Western blot法鉴定其特异性.结果 成功构建pGEX-4T-1/PBX3原核表达载体,转化BL21菌株后可高效表达GST-PBX3融合蛋白,且以不可溶包涵体形式存在.SDS-PAGE纯化蛋白并免疫小鼠产生的抗PBX3血清可特异识别细胞外源过表达的PBX3蛋白,同时可检测到细胞外源性PBX3蛋白的细胞内定位情况.结论 获得效价和特异性良好的PBX3多克隆抗体.
关键词： 前B细胞白血病同源盒基因3 融合蛋白表达 多克隆抗体 -
S100A10蛋白的表达及其抗体的制备
目的 制备S100A10蛋白及其特异性抗体.方法 用PCR扩增编码S100A10的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的蛋白产物经镍柱亲和层析纯化后,作为抗原皮内接种免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体,分别以ELISA,Western blot法检测抗体的滴度和抗原特异性.结果 成功构建原核表达载体pET28a(+)-(S100A10)2,得到纯化的(S100A10)2蛋白,制备的多抗具有较高的抗体滴度和抗原特异性.结论 建立了S100A10原核表达及纯化系统,成功制备了S100A10的多克隆抗体,为S100A10的进一步研究提供了工具.
