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Rheb1基因多克隆抗体的制备
目的:在大肠杆菌BL21中表达并纯化GST-Rheb1融合蛋白,以之免疫成年新西兰大白兔,获得Rheb1多克隆抗体.方法:运用PCR,限制性内切酶酶切及T4连接酶连接的方法,构建带有Rheb1基因的真核和原核表达载体;IPTG诱导GST融合蛋白高表达,通过皮下注射免疫新西兰大白兔,并取血清进行免疫印记分析抗体效价.结果:成功的制备了高效价的Rheb1兔多克隆抗体.结论:Rheb1多克隆抗体的成功制备,将为研究Rheb1基因的功能发挥重要的作用.
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Mre11多克隆抗体的制备及初步鉴定
目的 原核表达人Mre11蛋白,并制备出Mre11蛋白的多克隆抗体,为研究Mre11蛋白功能奠定基础.方法 以人cDNA文库为模板,构建出原核表达质粒PET41a-Mre11,然后转化受体菌E.coli BL21,再经IPTG诱导表达,通过采用GST亲和纯化获得GST-融合蛋白,将该融合蛋白免疫兔以制备出Mre11多抗血清,后采用western-blot 及免疫荧光等方法检测其在细胞中的特异性.结果 在受体菌E.coli BL21中成功诱导表达出了GST-Mre11融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得了高效价的Mre11蛋白抗血清,IP、western-blot及免疫荧光等多种方法检测证实该抗血清能够特异性识别293T和U2OS细胞株中Mre11蛋白,并能够正确清楚检测293T和U2OS细胞株中的Mre11表达情况,具有良好的特异性和高效性.结论 成功制备出了兔抗人Mre11蛋白的多克隆抗体,为深入研究Mre11蛋白在DNA损伤中的功能奠定了基础.
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Anti-NEP1-40多克隆抗体的制备与检测
目的 制备Anti-NEP1-40多克隆抗体.方法 合成NEP1-40多肽,采用弗氏佐剂制备免疫抗原,多次多点皮下注射健康雄性家兔,刺激机体产生相应抗体,颈动脉放血分离兔血清.结果 获得含NEP1-40抗体的免疫血清,其抗体特异性好,亲和力较高.结论 NEP1-40兔多克隆抗体可以满足NEP1-40相关的科学研究.
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家蝇u93基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备特异性的u93基因编码蛋白的多克隆抗体.方法:采用原核表达技术,体外诱导表达u93重组蛋白;采用蛋白免疫法,以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体;用ELISA法检测多克隆抗体效价,运用Western-blot方法对u93多克隆抗体的纯度和特异性进行分析.结果:制备的兔抗u93重组蛋白多克隆抗体效价为1∶4000,Western-blot结果显示该多克隆抗体能特异性识别u93重组蛋白.结论:成功制备u93基因编码蛋白的多克隆抗体.
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登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白多克隆抗体的制备
目的 翻备登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白的小鼠多克隆抗体并进行鉴定.方法 利用SDS-PAGE电泳的方法:将纯化后的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核表达蛋白浓缩,切割目的条带并研磨制成抗原,皮下多点分次注射BALB/c小鼠,采用Western-Blot,间接免疫荧光法对小鼠血清多克隆抗体进行鉴定.结果 经SDS-PAGE电泳成功地将纯化后的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原棱表达蛋白浓缩,并获取了抗登革Ⅱ型病毒M株,NGC株E基因部分序列原核表逸蛋白的多克隆抗体.结论 本实验中所用到的登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核蛋白为可溶性抗原,通过切胶研磨制成颗粒性蛋白抗原能获得良好的免疫效果,该方法制备的抗原浓度及纯度高,由此获得了高效价高特异性的多克隆抗体.
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抗人胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
目的: 制备胃癌相关蛋白GCRG224的多克隆抗体.方法: 在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰白兔,制备抗GCRG224的多克隆抗体.ELISA、 Western blot法鉴定抗体的效价及特异性.免疫组化染色观察GCRG224在胃癌和正常组织中的表达.结果: 在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约为16 800的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品.制备了抗GCRG224多克隆抗体.ELISA法检测抗体的效价达到1∶256 000,Western blot证实该抗体可与原核表达的GCRG224蛋白特异性结合.免疫组化染色显示GCRG224在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织.结论: GCRG224多克隆抗体的成功制备,为进一步深入研究GCRG224的生物学功能及其在胃癌发生发展中的作用奠定了基础.
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大熊猫秦岭亚种IL-2基因的克隆表达及其生物活性研究
目的: 明确大熊猫四川种群和秦岭种群IL-2在基因水平是否存在差异; 得到具有具有生物活性的秦岭大熊猫IL-2原核表达产物.方法: 采用RT-PCR方法从ConA诱导培养的秦岭大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到IL-2的cDNA片段, 利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32a-IL-2, 转入BL21(DE3)中, 以IPTG BL21(DE3)表达IL-2融合蛋白.融合蛋白进行SDS-PAGE和Western blot进行鉴定及可溶性分析; 用纯化的融合蛋白免疫家兔, 制备多克隆抗体; 采用淋巴细胞增殖试验测定融合蛋白生物活性.结果: 通过重组表达获得IL-2抗原蛋白, 相对分子质量(Mr)为34 000; 免疫家兔得到特异性的抗IL-2抗体, 该抗体能够检测细胞内源性IL-2蛋白的表达; 融合蛋白具有促进淋巴细胞转化增殖的生物学活性, 并且它的这种作用可被本研究制备的多抗所抑制.结论: 成功克隆了秦岭大熊猫IL-2基因, 与四川大熊猫核苷酸同源性为99.4%表达了具有生物活性的融合蛋白.
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猪FMDV受体β3亚基配体结合域的基因克隆及其多克隆抗体制备
目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体.方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEM T-easy载体相连构建pGEM/β3LBD,经BamH Ⅰ/Xho Ⅰ酶切后回收β3LBD片段,与同样酶切处理的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β3LBD,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达β3LBD蛋白.纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体.通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性.结果:猪β3亚基的LBD基因含有507个核苷酸,编码169个氨基酸,猪β3 LBD基因与牛、人、黑猩猩、猕猴、马、犬、挪威大鼠、家鼠、和鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90.3%、92.3%、92.1%、91.3%、90.5%、90.3%、87.8%、85.2%、79.5%.哺乳动物的β3亚基LBD基因同源性较高,与鸡的同源性较低.实现了重组猪β3 LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为44 000,制备的兔多克隆抗体效价达1:12800以上.结论:实现了猪FMDV受体β3 LBD的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备,为深入研究受体β3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础.
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口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析
目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD, 并制备兔抗β6LBD多克隆抗体.方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段, 经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体, 构建的 pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒, 转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株, 经IPTG诱导表达, SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体, 纯化目的蛋白.然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体, 以ELISA方法测定抗体效价, 并以Western blot鉴定其特异性.结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42 000的GST-β6LBD融合蛋白, 与预期结果相符.目的蛋白纯化后, 在电泳图片上显示较为清晰的单一条带, 用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上, 具有较高的特异性.结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体, 为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础.
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Red蛋白抗血清的制备及其亚细胞定位研究
目的:在大肠杆菌中分别表达3种Red蛋白,并制备兔抗Red蛋白的抗体.方法:从λ噬菌体基因组中,通过PCR分别扩增gam、bet和exo DNA的全长序列.将PCR产物克隆入非融合表达载体pDH2中,构建Red蛋白的高表达工程菌.通过温敏诱导表达3种Red蛋白(Bet、Exo和Gam),用PACTE薄层扫描检测目的蛋白含量.用3种Red蛋白分别免疫家兔制备抗血清,并以Western blot鉴定抗体的效价和特异性.结果:大肠杆菌中表达的Bet、Exo和Gam蛋白,分别占菌体总蛋白量的40.3%、49.2%和73.4%.3种抗血清的效价约为1:2000.Western blot分析显示抗血清具有较好的特异性.结论:成功地获得Bet、Exo和Gam3种蛋白,并分别制备了相应的抗血清.使用这3种抗血清,检测了3种蛋白在真核细胞中的表达和定位,为研究Red蛋白的同源重组奠定了基础.
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抗棉铃虫Ⅳ型几丁质酶(HaCHT4)小鼠多克隆抗体的制备与鉴定
目的 原核表达棉铃虫Ⅳ型几丁质酶(HaCHT4)并制备其多克隆抗体.方法 在大肠杆菌中表达组蛋白-HaCHT4融合蛋白(His-HaCHT4),镍柱纯化目的蛋白,经足垫加皮下注射免疫小鼠.4次免疫后,用ELISA检测抗His-HaCHT4多克隆抗体的效价,Western blot法检测其免疫特异性.结果 成功纯化His-HaCHT4融合蛋白,小鼠抗His-HaCHT4的多克隆抗体的滴度高于1∶204 800.Western blot结果显示该抗体能与His-HaCHT4融合蛋白及棉铃虫体中的天然HaCHT4结合,但不能与黄粉虫的蛋白结合.结论 成功原核表达和纯化了His-HaCHT4,制备了特异性的鼠多克隆抗体.
关键词： 棉铃虫 Ⅳ型几丁质酶(HaCHT4) 多克隆抗体 免疫特异性 -
兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)多克隆抗体的制备与应用
目的 制备兔抗小鼠睾丸表达蛋白33(Tex33)的多克隆抗体并检测Tex33在小鼠精子发生过程中的表达情况.方法 以成年小鼠睾丸组织cDNA为模板,PCR扩增Tex33基因可读框序列,终将PCR产物插入pET-30a载体,构建pET-30a-Tex33原核表达质粒.将原核表达质粒转化人大肠杆菌E.coli BL21中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达Tex33蛋白.利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,免疫成年雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体.ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot法及免疫荧光组织化学染色分析多克隆抗体效价及特异性.结果 成功构建了pET-30a-Tex33重组质粒,IPTG诱导下表达出Tex33重组蛋白.ELISA检测多克隆抗体滴度为1:1 000 000,Western blot法分析显示多克隆抗体能识别小鼠睾丸组织中的Tex33蛋白,免疫荧光组织化学染色显示Tex33在成年小鼠睾丸组织的精子细胞及精子均有表达,且定位于精子顶体及尾部.结论 成功制备出高特异性的兔抗小鼠Tex33多克隆抗体并发现Tex33在小鼠睾丸中表达.
关键词： 小鼠 睾丸表达蛋白33(Tex33) 多克隆抗体 精子发生 -
兔抗人copine-8蛋白多克隆抗体的制备
目的 制备人源copine-8(CPNE8)蛋白的多克隆抗体.方法 反转录PCR扩增HBE人支气管上皮细胞的CPNE8基因(编码CPNE8蛋白)并克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中,所得的重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白.谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化目的蛋白并基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定.以纯化的CPNE8蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.用ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色法检测抗体的效价和特异性.结果 成功构建了pGEX-4T-1-CPNE8表达载体,重组CPNE8蛋白在大肠杆菌中高效表达.ELISA检测结果显示抗体的效价达1∶64 000;此多克隆抗体可经Western blot特异性识别原核表达的CPNE8蛋白,并可适合免疫组织化学技术检测该蛋白在人正常肺组织和肺癌组织中的分布.结论 成功制备具有较好结合特异性的CPNE8蛋白多克隆抗体.
关键词： copine-8 (CPNE8) 原核表达 多克隆抗体 -
抗羊口疮病毒囊膜蛋白B2L小鼠多克隆抗体的制备和应用
目的 获取羊口疮病毒(ORFV)囊膜蛋白B2L并制备鼠抗B2L蛋白多克隆抗体.方法 采用PCR扩增获得B2L基因,并将其分别克隆至原核表达载体pET-32a和真核表达载体p3×FLAG-CMV-14.两个重组表达载体均经过鉴定,重组原核表达载体使用BL21大肠杆菌表达,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白.通过Tris-尿素溶液洗去非目的蛋白,Western blot法鉴定.将定量的纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗ORFV B2L多克隆抗体.将真核表达重组质粒p3×FLAG-B2L转染Vero细胞、BHK-21细胞,使用间接免疫荧光法(IFA)对抗B2L蛋白的多克隆抗体鉴定,并应用于免疫组织化学染色检测患病羊唇部组织ORFV的表达.结果 Western blot法确定了制备的B2L蛋白的特异性;IFA结果表明制备的小鼠抗B2L多克隆抗体有特异性和反应原性,免疫组织化学染色法结果表明该抗体可以检测出患病羊唇部组织的ORFV.结论 成功制备了特异性的小鼠抗B2L多克隆抗体.
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大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A(Ec-ZipA)原核表达、纯化与大鼠多克隆抗体的制备
目的 制备大肠杆菌丝状热敏蛋白Z相互作用蛋白A (Ec-ZipA)第185至328位氨基酸功能蛋白及其特异性大鼠多克隆抗体.方法 以基因合成法合成Ec-ZipA第185至328位氨基酸功能蛋白的基因序列,利用DNA重组技术与pET-30a(+)载体连接构建重组质粒.将重组质粒转化到E.coli BL21(DF3)中进行Ec-ZipA原核表达与表达优化.采用亲和层析方法分离纯化Ec-ZipA后,以荧光偏振(FP)实验进行生物学活性鉴定.以重组Ec-ZipA为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,采用ELISA和Western blot法检测抗体滴度和抗原特异性.结果 SDS-PAGE分析和Western blot实验证实大肠杆菌成功表达Ec-ZipA蛋白.FP实验表明纯化的Ec-ZipA具有良好的生物学活性.ELISA结果表明多克隆抗体具有较高的抗体滴度,效价可达1∶512 000.Western blot实验证实多克隆抗体具有良好的抗原特异性.结论 成功进行了Ec-ZipA原核表达、分离纯化并制备了大鼠抗Ec-ZipA多克隆抗体.
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小鼠抗人FOXO3保守区多克隆抗体的制备和鉴定
目的 纯化叉头盒蛋白O3(FOXO3)基因保守区蛋白,并制备其多克隆抗体.方法 利用生物信息学分析预测FOXO3蛋白的保守区,通过PCR扩增编码FOXO3蛋白第290～ 472位氨基酸DNA片段并克隆至pET28a原核表达载体中,转化到大肠杆菌BL21,诱导表达并获得可溶性蛋白,经镍离子柱亲和纯化,免疫小鼠制备抗血清,随后采用ELISA、Western blot法和免疫沉淀实验检测抗体的效价、特异性以及应用范围.结果 成功构建表达载体pET28 a-FOXO3 (aa290-472),实现可溶性FOXO3蛋白的表达和抗体制备.SDS-PAGE和Western blot实验结果证实,FOXO3蛋白与预期结果一致,抗血清能够特异性地识别原核、真核FOXO3蛋白以及其天然抗原表位.结论 成功制备了小鼠抗人FOXO3的多克隆抗体,且抗体对内源性FOXO3具有较好的反应性和特异性.
关键词： 叉头盒蛋白O3(FOXO3) 多克隆抗体 融合蛋白 -
抗ATRX-C2193-2492多克隆抗体的制备和鉴定
目的 制备X连锁的α地中海贫血/精神发育迟滞综合症(ATRX)蛋白C端的多克隆抗体,分析ATRX蛋白在宫颈组织中的表达和定位.方法 将纯化后的6 His-ATRX-C2193-2492蛋白免疫BALB/c小鼠,获得抗血清;饱和硫酸铵盐析沉淀法以及亲和层析法纯化抗血清,制备抗ATRX-C2193-2492多克隆抗体.采用ELISA检测抗体效价;并用Western blot法鉴定其特异性;利用免疫组织化学技术检测宫颈癌组织细胞中ATRX的表达与定位.结果 制备的ATRX-C2193-2492抗血清效价可达1:12 800,该抗体能特异性识别ATRX-C2193-2492蛋白;并检测出在宫颈癌癌旁组织中ATRX具有较高表达并主要定位在细胞核,而在宫颈癌组织细胞中虽仍主要表达于细胞核,但表达量明显减少.结论 成功制备了抗ATRX-C2193-2492多克隆抗体,能够应用于宫颈组织中的ATRX蛋白表达的检测.
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兔抗小鼠含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶)8(Setd8)多克隆抗体制备和应用
目的 在大肠杆菌表达小鼠含SET结构域(赖氨酸甲基转移酶)8(Setd8)蛋白并制备兔抗Setd8多克隆抗体.方法 将pGADT7-Setd8质粒和pET-30a载体分别双酶切后连接、转化和鉴定,构建pET-30a-Setd8原核表达质粒.将pET-30a-Setd8质粒转化到E.coli BL21中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,通过镍亲和层析柱进行蛋白纯化.应用纯化的Setd8蛋白免疫新西兰大白兔,获得Setd8多克隆抗体.利用ELISA、Western blot法及免疫组织化学染色法对所得多克隆抗体进行效价测定及特异性鉴定.结果 应用限制性内切酶双酶切后电泳及序列测定法,成功构建的pET-30a-Setd8重组质粒在大肠杆菌中IPTG诱导下能够高效表达重组Setd8蛋白.免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶1 000 000,Western blot法结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别细胞和组织中的Setd8蛋白,免疫组织化学染色法显示多克隆抗体识别的Setd8主要表达于成年小鼠睾丸组织中的精原细胞.结论 成功获得较高纯度Setd8蛋白,制备的Setd8多克隆抗体具有较高反应性和特异性.
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抗鸭坦布苏病毒非结构蛋白1(NS1)多克隆抗体的制备和应用
目的 原核表达鸭坦布苏病毒(DTMUV)非结构蛋白1(NS1)蛋白,并制备小鼠抗NS1多克隆抗体.方法 利用PCR从DTMUV AH-F10株cDNA中获得NS1基因,亚克隆至pET-32a中进行原核表达,对表达产物进行鉴定.使用含尿素的Tris缓冲液洗去杂蛋白再梯度复性,纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备小鼠抗NS1多克隆抗体,琼脂扩散试验测定抗体效价,Western blot法鉴定该抗体的特异性与反应原性,将抗体应用于病毒的间接免疫荧光法(IFA)检测.结果 获得鼠抗NS1蛋白多克隆抗体,效价达到1∶8;Western blot结果表明该多抗血清具有良好的特异性和反应性,且可以应用于病毒的IFA检测.结论 成功制备了鼠抗NS1多克隆抗体.
关键词： 鸭坦布苏病毒 非结构蛋白1(NS1) 多克隆抗体 原核表达 -
幽门螺杆菌σ54蛋白多克隆抗体的制备
目的 原核表达纯化幽门螺杆菌σ54蛋白,并制备σ54蛋白的多克隆抗体.方法 以幽门螺杆菌26695基因组为模板扩增完整的rpoN基因片段,并将其克隆到含有His标签编码序列的原核表达载体pTriExTM-4上,将重组质粒转化大肠杆菌JM109DE感受态细胞,在IPTG诱导下表达带有His标签的融合蛋白,利用His-Bind亲和柱进行蛋白的纯化,将纯化的蛋白辅以佐剂免疫家兔,制备σ54蛋白的多克隆抗体.结果 σ54蛋白在大肠杆菌JM109DE菌株中有较高表达,纯化后进行SDS-PAGE获得了与预期融合蛋白大小一致的单一条带.获得的σ54蛋白多克隆抗体具有较好的σ54蛋白结合性和特异性.结论 成功表达和纯化了σ54蛋白并制备了多克隆抗体.
