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小鼠 LIGHT 胞外段基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

徐莎;杨赟;余坚;周艺;陈丽丽

摘要: 目的:PCR 扩增小鼠 LIGHT 胞外段基因(LIGHTECD),构建含 LIGHTECD的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。方法:提取小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中的总 mRNA,RT-PCR 技术扩增 LIGHTECD,克隆至原核表达质粒 pGEX-6P-2中,构建重组表达载体pGEX-6P-2-LIGHTECD。重组质粒进行 PCR 和基因测序鉴定后,转化大肠杆菌 XL-1 Blue,IPTG 诱导表达。融合蛋白纯化后纯化后免疫新西兰兔,ELISA 及Western- blot 分析兔血清中抗 LIGHTECD抗体的效价和特异性。结果:RT-PCR 扩增得到525 bp LIGHTECD目的片段;经 PCR 和测序鉴定,证明构建的重组质粒中插入的片段为 LIGHTECD基因,测序结果经 BLAST 分析,与 Genbank 上登录序列完全一致;经 IPTG 诱导,重组质粒表达一相对分子量(Mr)约为45kD 的目的蛋白条带。ELISA 检测免疫兔血清效价为1∶20000。结论:成功地克隆了小鼠 LIGHT 胞外段基因,并表达了相应可溶性蛋白,准备了高效价的兔抗 LIGHTECD多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。

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