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FHL2抗体的制备及其在癌细胞和组织中表达的检测
目的:制备FHL2特异性的多克隆抗体, 并检测FHL2在癌细胞和组织中的表达.方法:在大肠杆菌中融合表达GST-FHL2蛋白, 纯化后免疫小鼠, 制备多克隆抗体.采用Western blot检测抗体的特异性, 并检测FHL2在乳腺癌细胞、肝癌细胞和小鼠组织中的表达. 结果:获得了可特异识别FHL2, 而不识别FHL家族其他成员的多克隆抗体;FHL2蛋白在乳腺癌和肝癌细胞株中表达;FHL2在心脏、肌组织、乳腺、前列腺和肝脏组织中都有表达.结论:成功地得到可特异识别FHL2的多克隆抗体, 且发现FHL2在癌细胞和更广泛地正常组织中都有表达, 为进一步研究FHL2在凋亡、癌变、分化等生命过程中的功能奠定了基础.
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宫颈癌相关新癌基因hWAPL的原核表达和免疫原性分析
目的: 构建hWAPL原核表达载体, 诱导hWAPL蛋白表达并制备其多克隆抗体.方法: RT-PCR技术扩增hWAPL cDNA片段, 连接到pMD18-T载体, 测序正确后亚克隆入原核表达载体pET28a并转化BL21菌株, 用SDS-PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况, 制备hWAPL蛋白并免疫BALB/c小鼠, ELISA法测定其抗体效价, Western blot鉴定表达hWAPL蛋白的免疫原性.结果: ①经PCR、双酶切鉴定和测序, 证实hWAPL正确插入pMD18-T载体, 序列正确.②经IPTG诱导的pET28a-hWAPL重组菌表达出相对分子质量(Mr)约为25 000的蛋白, 与预期蛋白Mr相符.③免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1∶ 3 200.④Western blot结果显示Mr约25 000处有反应蛋白条带.结论: pET28a载体能够表达hWAPL蛋白, 表达蛋白具有良好的免疫原性, 其免疫小鼠后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性.
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小鼠抗人BART多克隆抗体的制备和鉴定
目的:制备小鼠抗人源性BART的抗体.方法:采用原核系统表达人全长BART,经纯化后免疫小鼠制备抗BART的抗体,以Western blot、免疫组化染色法检测抗体的效价和特异性.结果:获得高效价的小鼠抗BART的抗体,该抗体能够识别大鼠脊髓组织中的BART分子.海马神经元和星形胶质细胞的免疫组化染色结果显示,BART分子在海马神经元、星形胶质细胞中广泛表达;在海马神经元中,BART与钙离子通道存在共定位现象.结论:制备出能特异性识别天然BART分子的抗体,为检测BART分子并进一步研究其功能奠定了基础.
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人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的:克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13, RPS13)cDNA全长, 构建原核表达质粒, 诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体.方法:应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长, 利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-RPS13, 双酶切及测序鉴定.将重组载体转化入大肠杆菌BL21中, 筛选抗性克隆并经DNA测序证实.IPTG诱导融合蛋白的表达, 利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白, 经SDS-PAGE和Western blot鉴定.用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠, ELISA法测定抗体效价, 饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体, Western blot检测抗体活性.结果:RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a(+)-RPS13构建成功, DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同.IPTG诱导3 h后, 经SDS-PAGE检测显示在Mr 19 000处出现一新生条带, 与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot, 结果证实融合蛋白表达成功.其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13.结论:成功地获得了RPS13的编码基因序列, 并获得了纯化的RPS13蛋白质, 为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础.
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QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定
目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI-7蛋白, 并制备其兔抗QKI多克隆抗体.方法:将成功插入QKI-7编码区cDNA的PET32b(+)原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3) 感受态细菌, 以IPTG诱导6×His-QKI-7融合蛋白的表达, 分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化.经SDS-PAGE和Western blot鉴定后, 应用纯化的融合蛋白, 分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、 NC膜作为佐剂免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 并以Western blot进行检测.结果:经表达并纯化的QKI-7蛋白纯度达到95%以上, 应用纯化的融合蛋白以弗氏佐剂作为佐剂免疫新西兰大白兔后获得高滴度, 特异性的抗QKI的多克隆抗体.结论:成功地表达并纯化了QKI-7蛋白, 并制备了高滴度、高特异性的抗QKI多克隆抗体.采用弗氏佐剂作为免疫佐剂进行免疫的效果优于聚丙烯酰胺凝胶和NC膜.
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兔抗人细胞色素P450 4A11合成肽抗体的制备与鉴定
目的:制备兔抗人细胞色素P450 4A11 (CYP4A11)抗体,并对其特性进行初步鉴定.方法:利用生物信息学方法分析CYP4A11蛋白的序列,根据亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构等指标选择多肽序列、合成CYP4A11多肽,与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联,免疫大耳白兔制备抗CYP4A11抗体.辛酸-硫酸铵法纯化抗体,对纯化的抗体进行ELISA、Western blot、免疫组化等鉴定.结果:获得抗CYP4A11合成肽的抗体.该抗体效价为1: 32000.可与CYP4A11合成肽及天然CYP4A11出现特异性反应,该抗体识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为53000,可识别正常肝脏的CYP4A11.结论:合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性,可用于制备相应的抗体.制备的兔抗CYP4A11合成肽抗体可应用于ELISA、Western blot、免疫组化等实验.
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人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备
目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法:将亚克隆构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化人大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定.结果:pET28a(+)/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mτ)为33 000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%.Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性.纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6.结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础.
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人致肺纤维化因子的重组表达和抗体制备
目的:进行人致肺纤维化因子的原核和真核表达,并利用原核表达蛋白制备兔抗人致肺纤维化因子多克隆抗体.方法:人致肺纤维化因子为同一基因的一组可变剪切产物,将其共有cDNA序列(ChS)插入质粒pQE-30,构建ChS-pQE表达质粒,转化大肠杆菌M15,表达菌株经IPTG诱导,获得大量不可溶的包涵体蛋白.以之为抗原免疫新西兰大白兔,制备出多克隆抗体.对该多克隆抗体初步检测证明获得较高滴度和较高特异性的抗体,并用Western blot鉴定这组cDNA连接到pcDNA3.1D载体后在真核细胞的重组表达.结果:原核表达的不可溶性重组蛋白也能成功地制备出多克隆抗体.结论:成功地表达了人致肺纤维化因子,并制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体,人致肺纤维化因子的表达和功能研究提供了一条途径.
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抗人β防御素3融合蛋白抗体的制备及其活性检测
目的:人抗菌肽β防御素3(HBD3)除具有杀灭多种病原菌的作用外,还参与机体免疫防御的多个过程,本实验的目的是进一步了解HBD3在人体的生物功能.方法:通过将编码HBD3成熟链的基因与载体pGEX-KG相连,表达出谷胱甘肽S转移酶与HBD3(GST-HBD3)的融合蛋白,制备HBD3的抗体.结果:通过Western blot检测及免疫组化方法证实HBD3抗体的制备成功,显示了HBD3蛋白在食道上皮细胞的表达部位.结论:为进一步了解HBD3在人体的功能及其在疾病状态下的改变奠定了坚实的基础.
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细胞色素P450 3A4抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定
目的:制备兔抗人细胞色素P450 3A4(CYP3A4)抗体及其特性鉴定.方法:利用生物信息学方法分析CYP3A4蛋白的序列, 根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列, 合成CYP3A4多肽, 与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联, 免疫日本大耳白兔制备抗CYP3A4抗体.辛酸-硫酸铵法纯化抗体, 间接ELISA测定抗体的效价及相对亲和力常数, Western blot鉴定其特异性, 免疫组化进行定位.结果:获得针对小分子CYP3A4的抗体.该抗体效价为1:16 000;相对亲和力常数在105～106 M-1, 具有实用价值;可与CYP3A4合成肽及天然CYP3A4出现特异性反应;可识别正常人肝脏组织CYP3A4;Western blot的结果显示, 该抗体识别的相应抗原的相对分子质量(Mr)为46 000.结论:合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性, 可用于制备相应的抗体.制备的兔抗CYP3A4合成肽抗体可应用于ELISA、 Western blot和免疫组化实验.
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FHL1抗体的制备与特异性鉴定
目的: 制备FHL1及其剪接体FHL1B、 FHL1C的多克隆抗体, 并对其特异性进行鉴定.方法: 融合表达GST-FHL1蛋白, 常规免疫小鼠, 制备多克隆抗体.分别构建带有FLAG标签的FHL1-5、 FHL1B、 FHL1C以及FHL1 N端和C端缺失突变体的真核表达载体.Western blot检测抗体的特异性.结果: 获得了FHL1-5、 FHL1B、 FHL1C及FHL1(1-169 aa)和FHL1(168-280 aa)的真核表达载体; 得到的多克隆抗体可特异识别FHL1、 FHL1B和FHL1C, 而不识别FHL2-5; 抗体与FHL1 N端反应, 而不与其C端反应.结论: 成功得到可特异识别FHL1、 FHL1B和FHL1C的多克隆抗体, 为进一步研究FHL1及其剪接突变体的功能奠定了坚实的基础.
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抗RIP3抗体的制备及其亚细胞定位
目的:制备兔抗受体相互作用蛋白-3(RIP3)的抗体,并探讨其在鼠源NIH3T3细胞株中的定位.方法:用RT-PCR技术从NIH3T3细胞株中克隆鼠rip3基因,进行原核表达及电洗脱纯化.以高纯度的RIP3抗原免疫新西兰兔制备抗血清并纯化.用Western blot检测该抗体的特异性,以免疫荧光法确定RIP3在NIH3T3细胞株中的定位,以及TNF-α和z-VAD.fmk对其定位的影响.结果:获得特异性的兔抗RIP3蛋白的抗体.免疫荧光的结果显示,RIP3定位于细胞质中.单用TNF-α或z-VAD.fmk处理NIH3T3细胞后,RIP3的定位均无明显变化;而用z-VAD.fmk和TNF-α共同处理细胞后,在核内外均有RIP3分布.结论:成功地克隆rip3基因并制备高特异性的兔抗RIP3抗体.RIP3在NIH3T3细胞株中定位于细胞质中,为进一步研究RIP3在TNF-α诱导的caspase非依赖的细胞凋亡途径中的作用奠定了基础.
关键词： RIP3 多克隆抗体 亚细胞定位 caspase非依赖的细胞凋亡途径 -
小鼠脂多糖应答蛋白LRP的大肠杆菌表达及其兔抗血清抗体的制备
目的:原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清.方法:参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签(EST)序列进行拼接,预测mlrp cDNA序列.用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA序列,克隆入pTAT载体中,构建mlrp的原核表达载体.以其转化在大肠杆菌中诱导表达后,将获得的His-TAT-mLRP融合蛋白免疫家兔,用丙酮沉淀全菌蛋白吸附法制备纯化的抗mLRP血清,用Western blot鉴定抗体的特异性.结果:预测的mlrp cDNA的长度为1 905 bp.将克隆获得的1 554 bp大小的mlrp-cDNA编码区序列插入pTAT质粒中,在大肠杆菌中表达出His-TAT-mLRP融合蛋白.以其免疫家兔,制备了特异性兔抗mLRP的血清.结论:mlrp的原核表达及特异性兔抗mLRP血清的制备,为进一步研究mLRP的功能奠定了基础.
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兔抗人CXCR3-B分子N端多肽多克隆抗体的制备与初步应用
目的: 获得兔抗人CXCR3-B分子N端第1～19、第17～35及第33～51个氨基酸多肽的多克隆抗体, 并对多克隆抗体进行初步鉴定和应用.方法: 应用Fmoc法化学合成CXCR3-B分子N端第1～19、第17～35及第33～51个氨基酸多肽, 经C18的RP-HPLC纯化后, 通过高碘酸钠法将纯化的CXCR3-B分子的多肽与KLH交联;皮下注射抗原免疫日本大耳白兔, 加强免疫得到抗血清, 应用蛋白G纯化获得多克隆抗体.对纯化的抗体进行ELISA、免疫印迹、免疫组化等初步鉴定和应用.结果: 分别化学合成CXCR3-B分子N端第1～19、第17～35及第33～51个氨基酸多肽, 纯化后多肽纯度分别为98%、 88.54%及80%, 达到免疫用抗原标准.多肽与KLH交联, 用于免疫动物.经纯化后的抗体效价分别为1∶ 32 000(0.1 mg/L), 1∶ 4 000(3 mg/L)和1∶ 1 000(10 mg/L).3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中相对分子质量(Mr)约为50的CXCR3-B分子, 相应抗原定位于3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中的血管内皮细胞.结论: 所制备的多克隆抗体可应用于ELISA、免疫印迹和免疫组化等实验, 为确定CXCR3-B分子的组织及细胞分布和定位、寻找CXCR3-B相互作用的分子提供了有力的工具.
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YZ-2蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体制备
目的: 生物信息学分析与脑缺氧密切相关的新蛋白质YZ-2, 以及制备其多克隆抗体.方法: 根据生物信息学分析预测出YZ-2蛋白质的二级结构、亲水性、抗原性等理化特性, 以这些分析预测为依据, 经过同源性检索后设计出一段由22个氨基酸组成的多肽, 免疫家兔得到多克隆抗体, 并用ELISA、 Western blot等方法鉴定其特异性和滴度.结果: ①成功分析预测其抗原性和亲水性;②制备了抗YZ-2蛋白多克隆抗体;③以此多克隆抗体经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹, 检测YZ-2蛋白的表达, 证实此抗体效价较高、特异性强.结论: 利用生物信息学较好地预测出YZ-2的亲水性和抗原性, 并成功制备了其较高特异性的多克隆抗体.
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胃癌抗原相关基因MPS-1的融合表达及兔抗GST-MPS-1抗体的制备
目的:在大肠杆菌中表达GST-MPS-1融合蛋白并制备兔抗GST-MPS-1抗体.方法:将MPS-1全长cDNA克隆至pGEX-5X载体内,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导GST-MPS-1融合蛋白的表达.以分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备抗GST-MPS-1抗体.用Western blot和细胞免疫荧光染色法,检测兔抗GST-MPS-1抗体的特异性.结果:经测序和酶切鉴定确认,MPS-1基因以正确的方式插入到载体中.此重组表达载体经IPTG诱导后,可高效表达相对分子质量(Mr)为36 000的GST-MPS-1融合蛋白.以融合蛋白免疫兔获得的抗血清,经ELISA检测效价达到1×105.Western blot和细胞免疫荧光染色证实,该多克隆抗体能与MPS-1蛋白特异性结合.结论:兔抗MPS-1特异性抗体的获得,为进一步检测MPS-1蛋白的表达和功能分析奠定了基础.
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人Toll 样受体-9胞外区N端蛋白的表达及其抗体的制备
目的: 构建人Toll 样受体-9(hTLR-9)基因5′端序列的表达质粒,在大肠杆菌中表达,并以表达的hTLR-9-N免疫小鼠制备抗体.方法: 构建 hTLR-9 基因5′端(707～1 167 bp)的硫氧还蛋白(thioredoxin)融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N.将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.5 mmol/L IPTG诱导下表达.表达产物用SDS-PAGE 进行鉴定.以8 mol/L 尿素溶解的包涵体作为免疫原,免疫昆明种小鼠制备抗hTLR-9-N的抗体.结果:融合表达质粒pET32a-hTLR-9-N在E.coli BL21 (DE3)中以相对分子质量(Mr)为31 000的包涵体形式表达;Western blot分析证明hTLR-9-N在大肠杆菌中得到正确表达.表达的目的蛋白初步纯化后的纯度达90%以上;以hTLR-9-N为抗原制备的抗血清效价为1∶25 600; 该抗血清可以与转染后稳定表达全长hTLR-9的HEK293细胞产生结合反应.结论:成功地在大肠杆菌中表达hTLR-9 N末端蛋白,制备的抗hTLR-9-N抗体可特异性结合表达全长hTLR-9的真核细胞.
关键词： 人Toll样受体-9 原核表达 多克隆抗体 -
CRF单克隆抗体和多克隆抗体制备及其在睡眠剥夺模型大鼠脑内的变化
目的:制备并鉴定促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的单克隆抗体(mAb)和多克隆抗体(pAb), 并研究其在睡眠剥夺模型大鼠脑内的变化.方法: 用CRF分别与牛血清白蛋白(BSA)和牛甲状腺球蛋白(BTG)交联, 制成免疫原和检测用的包被抗原.将BSA-CRF分别免疫新西兰大白兔和雌性BALB/c小鼠, 制备其mAb和pAb, 经 ELISA和免疫细胞化学染色等方法进行鉴定, 并用所获抗体观察CRF在正常成年大鼠睡眠剥夺48 h后脑内的变化.结果: 所获得的CRF pAb和9株mAb具有较高的效价、特异性及亲和力.其中, pAb和2株mAb(1D10, 2F4)可用于免疫组织化学染色.睡眠剥夺48 h后下丘脑室旁核、杏仁核中央亚核、终纹状核卵圆亚核等核团高表达CRF样阳性产物, 而对照组相关核团内则极少或未出现.结论: ①成功地获得可用于免疫组化染色的CRF mAb和pAb.②提示CRF在中枢神经系统对睡眠剥夺造成的应激反应的调节过程中具有重要的意义.下丘脑室旁核、杏仁中央核和终纹床核是脑内相关调节环路的一部分.
关键词： 促肾上腺皮质激素释放因子 多克隆抗体 单克隆抗体 脑 睡眠剥夺 -
DnaJ类分子伴侣PBP基因的原核表达及兔抗PBP抗体的制备
目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因, 并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性.方法: 应用RT-PCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBP cDNA.测序后将其克隆到表达载体pET-28a中, 并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化后, 用SDS-PAGE进行鉴定.以所获纯化的PBP免疫新西兰白兔, 制备兔抗PBP抗体.抗体的效价及特异性用Western blot进行测定和分析.结果: 扩增和克隆出了720 bp的PBP基因.构建的重组质粒pET28a-PBP在大肠杆菌中得到高表达, 诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清中, 纯化的PBP经SDS-PAGE鉴定呈单一条带.以纯化的PBP免疫兔, 制备了兔抗PBP抗体.Western blot鉴定证实, 该抗体可与原核表达的PBP特异性结合, 抗体效价为1: 1 600.结论: 在原核细胞中表达了具有生物学活性的PBP, 并以其为免疫原制备了兔抗PBP的抗体, 为进一步研究PBP的结构与生物学活性奠定了基础.
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候选hEra结合蛋白A19/GST的融合表达及其抗体的制备
目的:在大肠杆菌中表达候选人Era结合蛋白A19/GST融合蛋白, 并制备兔抗A19抗体.方法: 利用人Era蛋白全长作为诱饵, 进行胎肝cDNA文库的酵母双杂交筛选.将得到的候选人Era结合蛋白A19的编码基因序列克隆入pACT2载体中, 构建pACT2-A19.用PCR扩增A19蛋白的编码基因序列, 克隆入融合表达载体pGEX-4T3中, 构建A19的表达菌, 并经IPTG诱导表达A19蛋白.用SDS-PAGE分析及薄层扫描检测目的蛋白的含量.用A19蛋白免疫家兔制备抗血清, 以Western blot鉴定抗体的特异性并检测抗体的效价.结果: 大肠杆菌中表达的A19蛋白占菌体总蛋白的30.2%.Western blot分析显示, 抗血清具有较高的特异性, 其效价约为1: 4 000.结论: 成功地获得了候选的人Era结合蛋白A19, 制备了兔抗A19抗血清, 为后续Era功能的研究奠定了基础.
