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人呼吸道合胞病毒裂解条件的初步探索
目的 对人呼吸道合胞病毒(HRSV)的裂解条件进行初步探索,为研制HRSV裂解纯化疫苗奠定基础.方法 用不同的裂解剂,以不同浓度和温度对HRSV裂解不同时间,以HRSV的F及G蛋白为目标蛋白,对得到的蛋白进行还原蛋白电泳分析及Western blot鉴定,电镜观察验证裂解效果.结果 1%浓度的TritonX-100在4℃作用90 min,对HRSV的裂解效果优于其他裂解剂.电镜观察可见病毒样品呈云絮状裂解;Western blot分析表明,特异性条带为HRSV的F蛋白.结论 已初步筛选出HRSV的裂解条件,其对HRSV的裂解效果较好.
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单纯疱疹病毒2型表面糖蛋白D亚单位疫苗免疫佐剂的筛选及免疫方案优化
目的 筛选单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)表面糖蛋白(glycoprotein)D2 (gD2)亚单位疫苗的免疫佐剂,对免疫剂量、免疫次数等免疫方案进行优化.方法 使用Alum佐剂、Poly I:C佐剂及Alum+ PolyI:C混合佐剂,分别配伍不同剂量(2、5、10 μg)的gD2蛋白,共制成9种注射制剂,经后腿肌肉注射免疫9组雌性BALB/c小鼠,分别于初次免疫后第28和42天各加强免疫1次,于初次免疫后28 d及第2、3次免疫后14 d,经眼眶静脉窦取血,分离血清,ELISA法检测特异性抗gD2抗体效价;脱颈椎处死小鼠,分离研磨脾脏后,获得脾细胞,加入gD2抗原刺激培养71 h后,收集细胞上清,应用CBA试剂盒测定细胞因子(IL-2 、IFNγ 、TNF-α)浓度;确定佳免疫方案.结果 初次免疫后28 d,各组总抗体效价偏低,混合佐剂(Alum+ Poly I:C)配伍10 μg抗原组小鼠血清抗体效价高,但动物个体差异大.第2次免疫后14 d,各组小鼠血清抗体效价较第1次免疫显著增高;佐剂及抗原剂量对抗体效价影响显著,其中Poly I:C佐剂配伍10 μg抗原组小鼠抗体效价及细胞因子分泌水平综合高.末次免疫后14 d,小鼠血清中抗体效价较第2次免疫再次升高,动物个体间效价差异缩小,混合佐剂组效价高;各组细胞因子分泌水平较第2次免疫略有增高,混合佐剂配伍2 μg抗原组分泌高水平的IL-2、IFNγ、TNF-α.结论 小鼠免疫模型中,使用Alum+ Poly I:C混合佐剂较使用任一单独佐剂可产生佳免疫效果,佳免疫组为混合佐剂配伍2 μg抗原组,佳免疫次数为3次,第1和2次免疫间隔28 d,第2和第3次免疫间隔14d,佳免疫剂量为2 μg/只小鼠.
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不同抗原剂量的亚单位疫苗对小鼠的免疫效果
目的 研究不同抗原剂量的亚单位疫苗对小鼠的免疫效果.方法 将重组LTB-VP1和BSA蛋白分别用氢氧化铝吸附后,制备成不同浓度的亚单位疫苗,以100、50、20、10、5和1μg/只的剂量免疫昆明小鼠,共免疫3次.于初次免疫后第14、28、42、56天断尾采血,分离血清,采用间接ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平和特异性IgG1/IgG2a比率,并采用尿素变性法检测小鼠血清中抗体相对亲合力指数(abidity index,AI).结果 LTB-VP1和BSA抗原激发的抗体水平随免疫次数的增加而不断升高,与抗原剂量呈非线性关系,不同抗原的合适使用剂量也不相同.LTB-VP1抗原以20 μg/只剂量产生的抗体水平和抗体的AI值高;IgG1/IgG2a平均值为1.04,各剂量组Th1/Th2型免疫反应处在一种平衡状态.BSA抗原在5和100 μg/只剂量时激发的抗体水平相近,抗体的AI值差异有统计学意义(P＜0.05);IgG1/IgG2a平均值为2.4,各剂量组以Th2型免疫反应为主.结论 抗体水平不随抗原剂量的增加而增加,低剂量抗原即可产生较好的免疫效果,为兽用疫苗的临床使用提供了数据参考.
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产肠毒素大肠埃希菌K99-987P-F41融合蛋白在小鼠体内免疫效果的评价
目的 评价产肠毒素大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99-987P-F41融合蛋白在小鼠体内的免疫效果.方法 制备ETEC融合蛋白K99-987P-F41亚单位疫苗、ETEC全菌体灭活疫苗、ETEC天然菌毛K99-987P-F41混合蛋白亚单位疫苗及ETEC重组菌毛K99-987P-F41混合蛋白亚单位疫苗,分别免疫小鼠,同时以免疫PBS的小鼠作为对照.ELISA法检测小鼠血清中IgG、IL-4和IFNγ的水平及小鼠粪便和小肠冲洗液中分泌型免疫球蛋白A (secreted immunogobulin A,sIgA)的含量;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况,并进行攻毒试验.结果 ETEC融合蛋白K99-987P-F41重组亚单位疫苗组小鼠血清中的抗ETEC的特异性IgG抗体、IL-4、IFNγ、粪便和小肠冲洗液中的sIgA、小鼠脾脏B和T淋巴细胞增殖能力均显著高于PBS对照组(P＜0.05);ETEC融合蛋白K99-987P-F41重组亚单位疫苗对小鼠的保护率为80％,与其他3种疫苗的小鼠保护率相近,而PBS对照组为0.结论 ETEC融合蛋白K99-987P-F41可有效诱导小鼠产生较高滴度的特异性抗体,可作为ETEC重组亚单位疫苗候选蛋白.
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国产流感病毒亚单位疫苗的安全性及免疫原性
目的 观察国产流感病毒亚单位疫苗的安全性及免疫原性.方法 按照单盲法、随机、对照的原则,将900名观察对象分为幼儿组、儿童组、成人组和老年组,各组分别按2∶1的比例随机接种试验疫苗和对照疫苗(进口疫苗),观察各组接种后的全身反应、局部反应和其他不良反应以及免疫后HI抗体阳转率、保护率和GMT增长倍数.结果 观察组接种后全身反应发生率为8.33％,仅1例发生局部反应,不同年龄人群全身反应发生率与对照组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05)；免疫后观察组H1N1、H3N2和B(亚)型HI抗体总阳转率分别为87.90％、70.02％和71.32％,保护率分别为93.30％、93.30％和74.67％,与对照组相比,差异均无统计学意义(P＞0.05);GMT增长倍数分别为31.6、8.2和14.0,除H1N1亚型GMT平均增长倍数高于对照组外,其他两(亚)型与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 国产流感病毒亚单位疫苗具有与进口同类疫苗相似的安全性和免疫原性.
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结核分枝杆菌融合蛋白亚单位疫苗对BCG初始免疫的加强效应及保护效力
目的 探讨结核分枝杆菌融合蛋白亚单位疫苗对BCG初始免疫的加强效应及保护效力.方法 将Ag85B、Ag85B-Mpt64_(190-198)-HspX(AMH)、Ag85B-Mpt64_(190-198)-Mth8.4(AMM)以及AMH+AMM蛋白分别与佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)和卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)混合,制备亚单位疫苗.第0周用BCG皮下免疫C57BL/6小鼠,第8、10周分别用各蛋白疫苗皮下加强免疫,以PBS和BCG(仅免疫1次)作为对照.末次免疫后4周,采血检测血清抗体水平,并分离脾淋巴细胞,检测分泌IFNγ的水平;末次免疫后12周,经尾静脉注射H37Rv株,6周后取肺,进行菌落计数,抗酸及HE染色观察.结果 各亚单位疫苗加强组诱导产生的特异性抗Ag85B IgG抗体水平均明显高于BCG组;融合蛋白疫苗加强组免疫小鼠脾细胞经Ag85B和PPD刺激后,产生分泌IFNγ的淋巴细胞数明显多于BCG组;融合蛋白加强组免疫小鼠肺组织结核结节面积与BCG组比较,差异无统计学意义;仅AMM+AMH加强组免疫小鼠肺组织菌落计数明显低于BCG组,其抗酸染色阳性细菌数明显低于PBS、BCG及AMH、Ag85B加强组.结论 AMH和AMM疫苗联合加强BCG免疫,能诱导小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性,可增强BCG的保护效力.
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流感亚单位疫苗裂解剂残留量检测及安全性试验
目的 检测流感亚单位疫苗的裂解剂残留量,并观察其安全性.方法 制备3批流感亚单位疫苗,采用比色法检测其裂解剂Tween-80和CTAB的残留量,通过动物实验观察其安全性.结果 制备的3批疫苗样品,Tween-80的残留量平均在68.3～72.μg/ml之间,CTAB残留量平均在36.3～38.7μg/ml之间.在安全性试验中,豚鼠未出现过敏反应,小鼠和豚鼠未出现异常毒性反应.结论 制备的流感亚单位疫苗的裂解剂残留量符合拟定规程要求,安全性良好.
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中国株HIV-1融合基因gag-gp120在大肠杆菌中的表达
艾滋病是目前人类难控制、耗资大的一类病毒性疾病,引起艾滋病的主要病原为HIV-1.Gap蛋白是HIV-1的主要结构蛋白之一,它在病毒的复制、成熟、感染和形态维持等方面均起着重要的作用,并能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫.由于它在不同毒株间相对保守,因此,其诱导的抗体水平在临床上成为HIV感染的主要检测指标.Gp120蛋白是由HIV-1 Env蛋白经剪切而形成的,在gp120上的C2区及其羧基末端等都与中和抗体的产生有关,因此,它已作为首选的HIV-1亚单位疫苗和重要的诊断试剂.在大肠杆菌中表达外源基因具有操作简便,成本低廉等优点.尽管有些表达的产物不能被忠实地翻译后加工,但可作为检测和诊断方面的研究.
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蛋白质亚单位疫苗的前沿设计
疫苗的产生对人类健康的保障起着重大作用.从历史的角度而言,疫苗应用先于对免疫系统本身认识,并帮助人们对该系统进行深入的了解.随着科学的发展,特别是医学生物学、分子生物学以及用上述方法对人类较相近动物-小鼠的动物模型研究和人类本身存在免疫疾病的研究,使人们对免疫学与疫苗学有了较多的认识.现今人们把疫苗主要分为3大类别,即活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗.尽管减毒活疫苗仍将继续发挥作用,一些灭活疫苗也仍然在使用,但同亚单位疫苗相比,无论是减毒活疫苗还是灭活疫苗,由于许多非必要成分的存在,往往给接种者带来许多副反应,而且人们一直对一些活疫苗株有返祖危险性存在着忧虑,因此人们转向寻找成分比较简单的亚单位疫苗.亚单位疫苗包括结构与组成较为明确,并可以引起免疫保护的一类蛋白质、脂多糖和荚膜多糖类等微生物组份.本文将根据现今人们对蛋白质结构的认识,并利用电子计算机系统重点讨论蛋白质亚单位疫苗的设计.为讨论方便,先略述一下背景知识.
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结核病治疗性疫苗的研究进展
耐药结核分枝杆菌的出现以及由于免疫功能失衡导致的免疫耐受是阻碍结核病有效治疗的两个重要原因.治疗性疫苗能通过对已感染结核分枝杆菌的机体产生二次免疫激发,打破机体的免疫耐受,诱导保护性免疫应答而达到清除结核分枝杆菌的目的.目前,结核病治疗性疫苗研究主要集中在DNA疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗和死疫苗上.因其可纠正机体失衡的免疫状态,且对耐药性的结核分枝杆菌可产生同样的清除作用,所以,近年来结核病治疗性疫苗逐渐受到人们的关注和重视并取得了较大发展.
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HIV-1 CN54 Gag蛋白与DNA疫苗联合免疫策略研究
目的:通过蛋白疫苗与DNA疫苗联合免疫效果的分析,探讨这种免疫方案的优势.方法:用DNA质粒PVRC2000-syngag,在0,2,4周初始免疫BALB/c小鼠,在第6周用HIV-1 CN54 Gag 蛋白加强免疫,每间隔两周采小鼠尾血作结合抗体滴度变化的检测,在第10周处死小鼠,检测小鼠的体液和细胞免疫水平.结果: 小鼠在第1次免疫后两周就产生了特异性的结合抗体,抗体在4周开始快速增长,在Gag蛋白加强后两周达到高峰,之后开始缓慢下降.这种联合免疫组诱导出了细胞免疫和体液免疫,抗体亚型检测倾向于Th2型体液免疫.结论:本实验为提高亚单位疫苗免疫原性提供了新的免疫方法.为免疫策略的深入研究奠定了一定的基础,提供了一定的数据支持和启示.
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结核分枝杆菌P16蛋白的研究进展
P16蛋白是结核分枝杆菌主要的膜蛋白,对该菌的生存力和稳定性起重要的调节作用.P16蛋白主要以9个亚基的寡聚体形式存在,有抗蛋白酶的水解作用;在氨基酸序列有一α-crystallin结构,该结构与P16蛋白的分子伴侣活性密切相关;P16蛋白具有高效、自发的再折叠,再组装能力,具有极强的抗热性.P16蛋白具有较强的免疫原性,可作为预防结核的亚单位疫苗及血清学诊断试剂.
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用转基因植物生产病原微生物亚单位疫苗的研究现状
利用转基因植物生产病原微生物亚单位疫苗是一个新兴的领域,本文就生产流程、在转基因植物中表达成功的病原微生物亚单位疫苗和转基因植物疫苗的优缺点,提高亚单位疫苗抗原在转基因植物中的表达量,以及加强机体黏膜免疫反应的措施等方面作一综述.
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重组亚单位疫苗的表达系统
传统疫苗多是通过系列传代或用化学或物理的方法使某些成分失活后制成的,尽管很有效,却存在着毒力逆转引发疾病的危险.重组亚单位疫苗相对安全性高,具有较大的发展前景.重组亚单位疫苗抗原需具有一定的对于维持疫苗效率所必需的空间构型和翻译后修饰,它的抗原性受到所选用表达系统的影响.因此,在制备重组亚单位疫苗时就需对表达系统进行谨慎选择.本文就重组亚单位疫苗各种生产宿主的特性和适用范围作一简介.
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婴幼儿呼吸道合胞病毒主动免疫的新进展
在婴幼儿中,呼吸道合胞病毒是重要的呼吸道感染病毒之一.本文讨论该病毒候选疫苗的研制和开发,包括PFP-1、PFP-2和BBG2Na亚单位疫苗以及冷传代/热敏感突变株等.
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呼吸道合胞病毒G蛋白的相关研究
呼吸道合胞病毒G蛋白介导病毒附着在宿主细胞表面，且具有亚型间抗原结构变异大的特点，其抗原变异推测是呼吸道合胞病毒逃避已存在的免疫监视，引起反复感染的原因。了解G蛋白与免疫反应的关系对研制呼吸道合胞病毒亚单位疫苗，有效地防治该病毒感染具有重要意义。
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结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6家族的研究进展
ESAT-6家族蛋白是结核分枝杆菌早期分泌蛋白中具有较强免疫原性的成分之一，卡介苗中缺乏该家族的一些重要成分。近年对其分布、结构、免疫学特征以及生物学用途方面的研究较多，该蛋白在作抗结核分枝杆菌亚单位疫苗的候选抗原、DNA疫苗的候选基因以及作为结核分枝杆菌感染的免疫学诊断试剂等领域体现出良好的研究及应用前景。
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人乳头瘤病毒16型预防性疫苗的研究进展
人乳头瘤病毒16型(HPV16)与宫颈癌的发生关系密切,由于该病毒尚不能在体外有效培养,而限制了预防性疫苗的研究进展.目前通过分子生物学方法在体外表达HPV16病毒样颗粒(VLPs)成为预防性疫苗研究的热点.研究表明VLPs可诱导机体产生抗病毒攻击的细胞免疫和体液免疫应答,从而为预防性基因工程亚单位疫苗的研究提供了重要科学依据.
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痢疾疫苗的研究进展
经济发展水平的不平衡、卫生条件不能得到充分的改善、抗药菌株的不断出现,决定了当前迫切需要研制痢疾疫苗.由于对痢疾杆菌致病机制和机体抗感染免疫还不是很清楚,目前还没有一个真正实用的痢疾疫苗上市.本文对当前世界上研究较为广泛的减毒口服活疫苗和亚单位疫苗的构建原理及取得的成果和存在的问题作一综述.
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分枝杆菌脂质组分加强结核分枝杆菌亚单位疫苗效应的初步研究
分枝杆菌细胞壁含丰富的脂质组分，其中一些具有抗原性，或具有重要的免疫调节作用。为探讨这些脂质组分在结核分枝杆菌亚单位疫苗中的作用，研发有效疫苗，本研究对卡介苗（BCG ）细胞壁总脂成分进行萃取，用硅胶柱色谱法将其分离为非极性脂、中间极性脂和极性脂，检测各类脂质组分在人群中的免疫原性，并将总脂和各类脂质组分分别与佐剂二甲基三十六烷基铵（DDA）和Poly（I∶C）混合，进一步与结核分枝杆菌融合蛋白LT70（ESAT6‐Ag85B‐MPT64＜190‐198＞‐Mtb8．4‐Rv2626c）混合，构建含脂质的结核分枝杆菌亚单位疫苗。在小鼠BCG攻击模型中进行保护效率评价，包括BCG初免后含脂质亚单位疫苗的强化免疫保护效率评价。结果显示，结核病患者脂质特异性抗体IgG高于健康人群（ P＜0．05）。在小鼠BCG攻击模型免疫保护效果评价中，含脂质亚单位疫苗LT70‐总脂组小鼠肺部的荷菌数显著低于BCG组（ P＜0．05）。在BCG初免‐含脂质亚单位疫苗加强免疫策略中，LT70‐总脂和LT70‐中间极性脂组小鼠肺部荷菌数均低于BCG组（P＜0．01）和LT70组（P＜0．05）。研究表明，分枝杆菌脂质成分具有较强的免疫原性，与亚单位疫苗联合使用能增强亚单位疫苗的抗结核分枝杆菌效果。其中，中间极性脂类强化作用明显，值得深入研究。
