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RNA酶的发现与启示
酶的本质是蛋白质已经成为生物学领域的共识,然而美国科学家切赫(Thomas R.Cech)和奥尔特曼(Sidney Alt-man)在研究RNA分子剪切机制的时候观察到某些RNA能够自我进行切割和连接,表现出酶的性质,称为RNA酶.这一重大的发现引起了人们对酶的本质和生命起源问题的进一步探索,也使他们荣获了1989年的诺贝尔化学奖.
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贾第虫核糖核酸酶PRNA转录本3'端序列及其存在形式
目的 确定贾第虫滋养体内核糖核酸酶P(RNase P)RNA 3'端序列及其存在形式.方法 提取贾第虫滋养体总RNA,大肠埃希菌(E coli)Poly(A)聚合酶加polyA尾后,进行反转录,扩增出加polyA尾后的cDNA,经PCR及测序进行鉴定,确定其3 '端序列.应用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分别检测RNase P-GLsR15共转录体与RNase PRNA成熟体的总表达量,两者之差即为RNase P RNA成熟体的表达量,确定贾第虫RNase P RNA的存在形式.结果 RNase P RNA 3'cDNA大小约300 nt,3'端序列与GLsR15 3'端序列一致；RNase P-GLsR15共转录体和RNaseP RNA成熟体的总表达量与RNase P-GLsR15共转录体表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 已成功克隆了RNase P RNA 3'端序列,证实RNase P RNA和GlsR15的共转录体即为RNase P RNA成熟体的存在形式.
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核糖核酸酶家族几个重要成员研究进展
核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)是生物体内重要的核酸水解酶.它们的种类繁多,功能各不相同.总的来说,它们的主要生理功能是控制细胞内RNA的种类与数量分布;参与核糖核酸转录后的加工过程;与某些植物的衰老、自交不亲和、雄性不育有密切关系;而在动物细胞中还具有抗病毒和抗癌作用.本文就核糖核酸酶家族中的几个重要成员研究进展作一综述.
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颌下腺的研究进展
众所周知,颌下腺属于消化腺之一.近年的研究表明,颌下腺内含有多种生物活性物质.1936年,Werle和Roden首次报道在颌下腺中含有激肽释放酶,成为在颌下腺内发现的第一个生物活性物质.1960年,Cohen在小鼠颌下腺中检测到神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF),随后又分离出表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF).这些重要的发现引起众多研究者对颌下腺的兴趣.自此,人们从小鼠、大鼠等啮齿类动物的颌下腺中相继发现或分离出近30种有显著生物活性的多肽类物质.1980年,Barka将颌下腺所产生的生物活性物质归纳为四大类:(1)促细胞生长和分化的因子:如NGF、EGF、内皮生长刺激因子等;(2)促进内环境稳定因子:如激肽释放酶、肾素、生长抑素、胃泌素等;(3)调节因子:如脂肽酶等;(4)消化酶:如酸性磷酸酶,核糖核酸酶,淀粉酶等.Barka对上述颌下腺因子的种类、性质、分布特点及功能作了详尽的阐述,已成为人们深入研究颌下腺必不可少的参考文献.
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实时扩增技术在临床病毒学研究中的应用:优势与制约
众所周知,基因扩增技术包括聚合酶链反应(po1ymerase chain reaction,PCR)和核酸序列依赖的扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA).PCR技术可以RNA或DNA为模板,以RNA为模板时先进行逆转录反应;而NASBA技术则是专一的以RNA为模板的基因扩增技术,其扩增过程需3种酶的参与,其分别是鸟髓母细胞增多症病毒逆转录酶(avian myeloblastosis virus reverse transcriptase,AMV-RT)、核糖核酸酶H和T7RNA聚合酶.
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第五讲急、慢性胰腺炎的酶学变化
胰腺是一个具有内分泌和外分泌双重功能的重要器官.其中胰岛是内分泌腺,能分泌胰岛素、胰高糖素、生长抑素等激素.胰腺腺泡是外分泌的功能单位,其所分泌的胰液含有丰富的碳酸氢盐和消化蛋白质、脂肪和糖类的酶.本文主要复习急、慢性胰腺炎时的酶学变化.一、胰腺细胞内酶的研究正常胰腺分泌多种消化酶,其中以淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶为主,还有磷脂酶A2、弹性蛋白酶、核糖核酸酶等[1].在胰腺内除淀粉酶、脂肪酶和核糖核酸酶为活性酶外,其余均以无活性的酶原形式存在,因而可防止胰腺自身消化.目前的共识认为,急性胰腺炎基本的发病机制仍应为激活的胰酶逸入胰腺组织引起胰腺自体消化.因此,研究急性胰腺炎状态下各种胰酶的作用具有重要意义.
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抗肝癌单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase的导向治疗作用
目的:观察抗肝癌重组单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase对荷人肝癌裸鼠移植瘤的导向治疗作用,并探讨其临床应用价值.方法:将原核表达载体TIG-hdsFv-RC-RNase转化E.coli BL21(DE3)plys中,利用IPTG大量诱导表达抗肝癌hdsFv-RC-RNase重组单链免疫毒素.表达产物在非变性条件下经Ni-NTA Agarose亲合层析法纯化并体外复性,利用细胞ELISA法检测其特异性结合体外培养的人肝癌细胞的免疫活性.建立荷人肝癌裸鼠移植瘤动物模型,初步评估其对荷人肝癌裸鼠移植瘤的导向治疗作用.结果:工程菌经IPTG诱导后,出现一条相对分子质量约为41 000的新生蛋白带,且主要以可溶性形式表达.纯化后表达产物的纯度达到基本均一.细胞ELISA检测结果显示,纯化产物复性后能够与体外培养的人肝癌细胞特异性结合,而对正常肝细胞的结合能力非常弱,两者具有非常显著的差异﹙P＜0.01).导向治疗结果表明,其对荷人肝癌裸鼠移植瘤治疗有效率为100%,与生理盐水组相比具有非常显著的差异(P＜0.01),抑瘤率达到79.38%.结论:成功获得了特异性强的有活性的抗肝癌重组单链免疫毒素hdsFv-RC-RNase,其对荷人肝癌裸鼠移植瘤具有一定的导向治疗作用,可能成为抗肝癌导向治疗药物.
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中华眼镜蛇毒核糖核酸酶的分离纯化及其特殊生物学活性
目的 从中华眼镜蛇毒中分离纯化核糖核酸酶,并研究其生物学活性.方法 以中华眼镜蛇毒为原料,采用SP-Trisacryl阳离子交换色谱、Sephadex G-75凝胶色谱、C8反相色谱等纯化方法,分离纯化具有核糖核酸酶活性的蛋白质,表征其酶学性质,检测其抑菌性、抗肿瘤细胞作用及抗氧化作用.结果 SDS-PAGE电泳显示纯化的中华眼镜蛇毒核糖核酸酶(Na-Rnase)为相对分子质量为13 000的单一成分.该酶适反应温度为40 ℃,适pH值为6.5,米氏常数为3.67 μmol/L,大反应速率为3.52 pmol/s.在体外抑菌实验中,在8 μmol/L的浓度下对大肠艾希菌和金黄葡萄球菌均未显示出显著抑制作用;在体外细胞毒性实验中,对于Hela肿瘤细胞和正常的人成纤维细胞在8 μmol/L的浓度下无明显抑制作用;在抗氧化实验中,浓度达到71.5 μmol/mL时,对小鼠肝微粒体脂质过氧化反应的抑制率为41.30%.结论 中华眼镜蛇毒中的核糖核酸酶具有抗氧化作用,可能作为氧化还原的调节剂,在有关的疾病治疗方面具有应用的潜能.
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抗肿瘤核糖核酸酶Onconase研究进展
Onconase是第一个进入Ⅲ期临床研究的核糖核酸酶药物,用于治疗恶性间皮瘤.属于RNase A超家族,RNase活性低,细胞毒性强,体内、体外对多种肿瘤具显著杀伤作用;同时具有抗病毒活性,尤其是抗人类免疫缺陷病毒功能是今后研究和开发的重点.此文综述了Onconase的研究历史与现状,包括Onconase的结构和功能之间的关系,抗肿瘤、抗病毒作用的机制,药物开发进展、毒副反应等.
关键词： Onconase 核糖核酸酶 抗肿瘤 抗病毒 Ⅰ型人类免疫缺陷病毒 -
来源于中国青蛙的一种核糖核酸酶新基因的克隆和序列分析
恶性肿瘤的生物治疗进年来有许多新的进展[1-2].在抗恶性肿瘤的生物治疗中,核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)是应用较广的一种制剂.根据文献报道,从日本稻田蛙、北极豹蛙和牛蛙等蛙的卵和早期胚胎中,分离纯化得到的一种核糖核酸酶具有细胞毒性强、相对分子质量小和对肿瘤细胞有选择性杀伤作用等优点[3-5],对正常分化细胞几乎不起作用,其体外抑制肿瘤细胞的半抑制浓度仅为10-7～10-6mol/L[6-8],而且其作用不受RNase抑制剂(Rnase inhibitor,RI)的影响[9].
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耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达
目的 为耐核糖核酸酶(RNase)的RNA标准品和质控品的表达制备提供一个通用载体平台.方法 将 MS2 噬菌体基因组中包括的成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因编码序列的1.7kb cDNA目的 片段,用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后,与用相同内切酶酶切的表达载体质粒pET28b,在T4 DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pI NCCL,再转化BE21-DE3 E.Coli进行原核表达.结果 成功构建得到了新的表达载体pI NCCL,经原核表达为耐RNase的病毒样颗粒.结论 本研究得到的pI NCCL表达载体及原核表达系统,可作为一个耐RNase的RNA标准品和质控品的构建和制备表达通用载体平台,将促进有关标准品和质控品的研究.
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耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达
目的 为耐核糖核酸酶(RNase)的RNA标准品和质控品的表达制备提供一个通用载体平台.方法 将MS2噬菌体基因组中包括的成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因编码序列的1.7kb cDNA目的 片段,用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切后,与用相同内切酶酶切的表达栽体质粒pET28b,在T4 DNA连接酶的存在下连接,构建一新的表达载体pI NCCL,再转化BL21-DE3 E.Coil进行原核表达.结果 成功构建得到了新的表达载体pI NCCL,经原核表达为耐RNase的病毒样颗粒.结论 本研究得到的pI NCCL表达载体及原核表达系统,可作为一个耐RNase的RNA标准品和质控品的构建和制备表达通用载体平台,将促进有关标准品和质控品的研究.
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血管生成素的研究进展
血管生成素(angiogenin,ANG)初是从肿瘤细胞中发现的一种碱性多肽调节因子,可以有效地促进内皮细胞(EC)的增殖、分化和迁移,介导细胞间的黏附以形成新的微血管管腔.血管生成素具有低核糖核酸酶活性,是胰腺核糖核酸酶超家族成员;外源ANG作用于血管内皮细胞的方式有两种:一种是通过经典的胞内信号系统;另外,ANG还可以由自身的核定位序列引导进入细胞核发挥作用.ANG参与多种生理和病理变化,在胚胎发生、子宫内膜变化、创伤愈合以及肿瘤的形成和发展、糖尿病等多种疾病中发挥重要的作用.
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反义药物的作用机理与临床应用
反义药物是以反义核酸技术为基础开发的以治疗为目的的安全有效的新型药物。与传统的药物相比较，反义药物的性质和作用对象明显不同，表现为：新的化学物质-寡聚核苷酸；新的药物受体-mRNA(信息核糖核酸)；新的受体结合方式：Watson-Crick杂交；新的药物受体结合后反应，如RNase H(核糖核酸酶H)介导的靶RNA的降解［1］。近年来，随着对反义寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)及其结构衍生物如硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(phosphorothioate oligodeoxynucleotides,PS-ODN)反义作用机理的阐明，大批以病毒、癌基因、细胞活性因子及其他疾病相关蛋白的基因为靶点的反义药物相继进入临床试验阶段，使反义药物的研究再次进入蓬勃发展时期。本文将在综述文献的基础上，对反义药物的作用机理及临床应用作如下介绍。
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分泌性表达载体V-pLNCX-s-hri对小鼠B16黑色素瘤生长的抑制作用
背景与目的:已有研究表明从人胎盘中提取纯化的人核糖核酸酶抑制因子(human ribonuclease inhibitor,hRI)对小鼠某些实体肿瘤的生长具有明显的抑制作用.本研究的目的是构建分泌性表达载体V-pLNCX-s-hri,并观察其对小鼠B16黑色素瘤生长的抑制作用.方法:将合成的小鼠IgG信号肽碱基序列与hRl基因序列连接后,重组到逆转录病毒载体V-pLNCX 上构建分泌性表达载体V-pLNCX-s-hri.将PA137细胞用于病毒包装,NIH3T3细胞用于测定病毒滴度.采用RT-PCR和Western blot法检测hRI基因的表达.构建小鼠荷B16黑色素瘤模型,注射V-pLNCX-s-hri,同时用生理盐水、V-pLNCX和V-pLNCX-hri作为对照.用肿瘤组织重和微血管密度来评价V-pLNCX-s-hri对小鼠B16黑素瘤生长的抑制作用.采用ELISA方法测定B16细胞培养上清和小鼠血清中RI含量.结果:V-pLNCX-s-hri对培养的B16细胞的感染效率为38.5%.在感染V-pLNCX-s-hri后的B16细胞中检测到RI mRNA和蛋白的表达.感染后的B16细胞的培养上清中hRl的含量为0.228μg/mL.V-pLNCX-s-hri组小鼠外周血中RI的含量为0.249 μg/mL.明显高于生理盐水组、V-pLNCX组和V-pLNCX-hri组的0.035 μg/mL、0.028 μg/mL和0.169 μg/mL(P值均<0.01).生理盐水组、V-pLNCX组和V-pLNCX-hri组小鼠的瘤组织重分别为(1.90±1.12)g、(1.77±0.21)g和(1.10±0.46)g,显微镜下每10个视野的微血管平均数分别为89±6、87±7和41±8;而V-pLNCX-s-hri组的瘤组织重为(0.82±0.34)g.血管平均数为34±4.V-pLNCX-s-hri组与各对照组相比,其瘤组织重和血管数量的差异都有统计学意义(P值均<0.01).结论:构建的分泌性表达载体V-pLNCX-s-hri能对B16细胞进行有效的感染,且在感染的B16细胞中分泌性高表达.V-pLNCX-s-hri对小鼠B16黑色素瘤的生长有明显的抑制作用,且效果优于V-pLNCX-hri.
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HSS的研究进展
肝细胞刺激物质(HepaticStimulatorySubstance,HSS)是目前唯一能特异性地促肝细胞生长的小分子蛋白,由于其特异性地促肝细胞生长的活性[1],参与肝细胞再生的调控等,故一直是肝炎治疗、肝细胞调控的研究热点.HSS的分子量约为12～18KD,耐热,在PH2～9的环境中仍能保持其生物学活性;不溶于乙醇,对蛋白酶敏感,但核糖核酸酶不影响其活性,其二硫键、三级结构的破坏不影响其活性.HSS存在乳肝组织或再生肝组织的肝细胞胞浆中,在非肝细胞中未发现HSS.HSS是由肝细胞合成的,是肝细胞的基因表达产物,肝细胞膜上有相应的受体.目前已能从猪、牛、鼠等多种动物的乳肝组织及人胎肝组织提取出HSS,但尚不能通过基因重组的方法获得.本文对HSS的研究现状作一综述.
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病毒性乙型肝炎基因治疗的研究进展
目前,国内外应用于慢性病毒性乙型肝炎的抗病毒药物有干扰素、核苷类似物等,虽然有一定疗效,但还不能彻底根除乙肝病毒在体内的慢性感染,停药后病毒仍可能继续复制,导致病情复发.学者们一致认为,抗病毒治疗已成为控制慢性乙肝病情发展的关键所在.
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带有蛋白转导域的靶向核糖核酸酶对乙型肝炎病毒复制的影响
究表达并纯化了带有蛋白转导域HIV-TAT的靶向核糖核酸酶,将其加入到2.2.15细胞的培养上清液中,观察其对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响及对细胞有无毒性,以便为靶向核糖核酸酶用于临床治疗HBV感染奠定基础.
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靶向核糖核酸酶对乙型肝炎病毒复制的作用
通过定量检测上清液中的乙型肝炎e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA),进一步研究靶向核糖核酸酶对HBV复制的影响.
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抗Caspase-12核酶的制备与体外活性鉴定
目的设计针对小鼠内质网应激凋亡途径中Caspase-12 mRNA的锤头状核酶(Rz138、Rz218),通过靶基因及核酶的体外转录、切割,进行核酶活性鉴定,评估其应用前景.方法小鼠Caspase-12基因的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增片段克隆于PGEM-T载体的T7启动子下游,通过α-32p UTP标记的体外转录物作为靶RNA.设计合成针对小鼠Caspase-12 mRNA的核酶,通过PCR方法扩增核酶的转录模板,采用非同位素标记法行体外转录,核酶与靶RNA进行体外切割实验.结果在37℃,Rz138、Rz21g均有切割活性,Rz138的切割效率较高,几乎100%.结论 Rz138在体外具有良好的特异催化切割活性,它有望通过切割Caspase-12 mRNA而抑制内质网应激介导的细胞凋亡发生.
关键词： 核糖核酸酶 转录 Caspase-12 活性鉴定
