首页 > 文献资料
-
脑源性神经营养因子在着床前小鼠胚胎中的表达及其对胚胎发育的影响
目的 检测脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体TrkB在植入前胚胎中的表达情况,探讨BDNF对小鼠早期胚胎发育和着床过程中的作用. 方法 收集小鼠受精后1～4 d的胚胎,利用免疫组化和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDNF及其受体TrkB在各阶段胚胎中的表达情况.将2细胞阶段的胚胎放入添加不同浓度的BDNF的培养基中,添加或不添加TrkB受体阻断剂k252a/k252b,观察胚胎发育情况,并对形成的囊胚进行细胞计数.在注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)后72 h、76 h、84 h和88 h分别腹腔注射10 μg K252a/k252b,收集胚胎,计算扩张期囊胚数和囊胚细胞数. 结果 BD-NF及TrkB均表达于小鼠植入前各阶段的胚胎中,在培养基中添加BDNF后能够促进小鼠胚胎的体外发育,能够提高囊胚形成率和囊胚孵化率,并能够提高滋养层细胞数,此作用能够通过TrkB受体阻断剂k252a而阻断.体内研究进一步证实,k252a处理后能够抑制囊胚细胞数而明显抑制早期胚胎发育. 结论 BDNF/TrkB信号系统可能通过某种自分泌或旁分泌的作用方式促进植入前胚胎的发育,同时也可能参与胚胎的着床过程.
-
酪氨酸激酶受体B-脑源性神经营养因子信号传导通路对神经母细胞瘤细胞分泌血管内皮生长因子及基质金属蛋白酶-9的影响
目的 探讨酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)-脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)信号传导通路对神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞SH-SY5Y分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的影响.方法 用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导SH-SY5Y细胞表达TrkB,加入外源性BDNF,从而激活TrkB-BDNF信号传导通路及其3条下游信号通路.再用特异性酪氨酸激酶抑制剂K252a阻断TrkB-BDNF信号传导通路；用磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-hydrox y kinase,PBK)抑制剂LY294002、磷脂酶C抑制剂U73122、丝裂原活化蛋白激酶抑制剂U0126分别阻断TrkB-BDNF的3条相应下游信号传导通路.采用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中VEGF及MMP-9含量.结果 ATRA+ BDNF组VEGF[(485.89±109.99) pg/ml]及MMP-9[(15.73±1.72) pg/ml]含量明显高于对照组及ATRA组(P ＜0.05)；ATRA+ BDNF+ K252a组VEGF[(272.42±86.33) pg/ml]及MMP-9[(5.25±1.44) pg/ml]含量明显低于ATRA+ BDNF组(P＜0.05),与对照组及ATRA组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；ATRA+ BDNF+ LY294002组VEGF[(314.12±24.68) pg/ml]及MMP-9[(4.91±1.08) pg/ml]含量明显低于ATRA+ BDNF组(P＜0.05),与对照组及ATRA组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)；ATRA+ BDNF+ U73122组VEGF[(444.08±64.49) pg/ml]及MMP-9[(13.28±3.38) pg/ml]含量与ATRA+ BDNF组比较差异无统计学意义(P＞0.05).ATRA+ BDNF+ U0126组VEGF[(429.97±19.95) pg/ml]及MMP-9[(13.96±4.45) pg/ml]含量与ATRA+ BDNF组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 激活TrkB-BDNF信号传导通路可促进NB细胞合成、分泌VEGF及MMP-9.TrkB-BDNF信号传导通路可能通过进一步激活其下游PI3 K/Akt通路来促进VEGF及MMP-9的合成及分泌,用K252a阻断TrkB-BDNF信号通路、LY294002阻断其下游PI3K通路均可有效抑制NB细胞合成及分泌VEGF及MMP-9.
-
k252a抑制BDNF - TrkB信号传导通路对电刺激点燃大鼠Arc表达及癫痫发生的影响
目的 探讨BDNF - TrkB信号传导通路与杏仁核电刺激点燃大鼠Arc表达及癫痫发生的关系.方法 雄性SD大鼠随机分为空白组、假手术组、杏仁核点燃组(单纯点燃组、k252a注射组、DMSO对照组).应用Alpha - Lab 4通道信号采集及处理系统记录大鼠脑电活动.运用免疫组化检测其Arc蛋白的表达水平,采用RT - PCR、原位杂交检测Arc mRNA在海马中表达水平.结果 k252a注射组大鼠V级发作持续时间(33.00±1.41)8显著低于单纯点燃组(60.50±2.07)s、DMSO对照组(60.00±1.79)s大鼠V级发作持续时间(P＜0.01).k252a注射组3h、6hArc阳性细胞百分率显著低于单纯点燃组、DMSO对照组3h、6hArc阳性细胞百分率(P＜0.01),12 h时5组间Arc阳性细胞百分率相比表达差异无统计学意义(F =0.684,P＞0.05).RT - PCR、原位杂交结果显示:k252a注射组1h、3 h Arc mRNA表达量显著低于单纯点燃组、DMSO对照组1h、3 h Arc mRNA表达量(P＜0.01).6h时5组间Arc mRNA相比表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 k252a能够抑制BDNF - TrkB 信号传导通路对Arc表达的诱导作用从而使癫痫发作的持续时间缩短.
关键词： 杏仁核 癫痫 活性调节细胞骨架蛋白 k252a 脑源性神经生长因子 -
梓醇保护L-谷氨酸和Aβ25-35损伤PC12细胞作用比较
目的 观察梓醇对L-Glu和Aβ25-35损伤PC12细胞的保护作用的异同.方法 常规培养神经元样PC12细胞,预先加入梓醇及对照生理盐水24 h后分别加L-Glu 5 mmol/L和Aβ25-35 20μmol/L损伤24 h,K252a 干预组细胞在梓醇前1 h加入200 nmol/L K252a.MTT法测定细胞存活率,放射配基结合分析测定M2受体密度.结果 梓醇100 μmol/L明显提高细胞存活率(P<0.01),10 μmol/L、100 μmol/L升高M2受体密度(P<0.05,P<0.01),K252a部分阻断梓醇对Aβ25-35 损伤细胞的保护作用,对梓醇保护L-Glu损伤的阻断作用更强.结论 梓醇对L-Glu和Aβ25-35损伤PC12细胞保护作用有差异.
-
K252a在大鼠海马全脑缺血/再灌介导的神经元损伤中对JNK下游信号通路的影响
目的：检测K252a在大鼠海马全脑缺血/再灌介导的神经元损伤中对JNK下游信号通路的影响。方法采用SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，于缺血前20 min脑室注射K252a，用免疫沉淀、免疫印迹和免疫组化的方法研究K252a在大鼠海马全脑缺血/再灌注介导的神经元损伤中对JNK下游信号通路的影响。结果在海马的CA1区，K252a可以明显抑制脑缺血介导的JNK核底物c-jun的磷酸化和Fasl蛋白的表达，以及Fasl和Fas结合的增高。结论缺血前20 min脑室注射K252a可以明显抑制JNK介导的死亡受体信号通路。
-
K252a对表达TrkB的NB细胞耐药性的影响
目的:使用全反式维甲酸(ATRA)诱导SH-SY5Y NB(SY5Y)细胞的TrkB表达,加入BDNF激活TrkB/BDNF信号传导通路使TrkB磷酸化,然后用特异性酪氨酸激酶抑制剂K252a阻断该通路,观察NB细胞对化疗药物-顺铂(CDDP)敏感性的变化.方法:用ATRA诱导SY5Y细胞的TrkB高表达后,用BDNF、CDDP和TrkB信号传导通路的特异性阻断剂-K252a处理,MTT法检测细胞的存活率变化;流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率;应用免疫组化法检测细胞磷酸化TrkB(p-TrkB)的表达水平.结果:ATRA能特异性诱导TrkB的表达,加入BDNF后可激活TrkB/BDNF信号传导通路并能引起TrkB的自动磷酸化;K252a能够阻断TrkB的磷酸化和TrkB/BDNF信号传导通路;经CDDP处理的SY5Y细胞的存活率下降、凋亡率上升.结论:阻断TrkB/BDNF信号传导通路可提高共表达TrkB/BDNF的NB细胞的化疗敏感性.因此,应用TrkB的抑制剂治疗NB有望提高该病的临床治愈率.
关键词： 神经母细胞瘤 TrkB/BDNF信号传导通路 化疗耐药 k252a -
BDNF/TrkB通路活化星形胶质细胞对大鼠神经病理性痛的影响
目的 观察外源性脑源性神经营养因子(BDNF)对大鼠机械痛阈和星形胶质细胞的影响,探讨BDNF参与疼痛调控的可能机制.方法 将30只鞘内置管成功的大鼠随机分为空白对照组、安慰剂组、BDNF组、BDNF+星形胶质细胞抑制剂组(BDNF+氟代柠檬酸组)及BDNF+酪氨酸激酶受体B(TrkB)抑制剂组(BDNF+ K252a组),每组6只.予鞘内注入药物,1次/d×7 d.每次注药前1h测定50％机械缩爪阈值(50％ PWT);末次给药后1h取脊髓腰膨大,Western blotting法测定胶质细胞纤丝酸性蛋白(GFAP)及磷酸化TrkB的蛋白表达.结果 BDNF组大鼠后肢50％ PWT较空白对照组显著下降(P＜0.05);给药后第7天,BDNF组大鼠脊髓腰膨大GFAP和磷酸化TrkB的蛋白表达较空白对照组显著升高(P＜0.01).BDNF+氟代柠檬酸组和BDNF+K252a组50％ PWT和GFAP蛋白表达水平与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).BDNF+ K252a组磷酸化TrkB的蛋白表达与空白对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 BDNF可能通过磷酸化TrkB受体使脊髓星形胶质细胞活化,进而参与神经病理性痛的发生和发展过程.
-
K252 a对局灶性脑缺血大鼠神经保护作用的在体研究
目的：研究K252 a对大脑中动脉栓塞导致的大鼠局灶性脑缺血模型的作用。方法成年雄性SD大鼠，随机分为K252 a组、溶剂对照组、手术组和假手术组，采用大脑中动脉栓塞法建立局灶性脑缺血模型，于造模前30 min分别侧脑室注射K252 a、溶剂或不予处理，造模前和复灌后24 h分别进行行为学评分，动物处死后进行TTC染色，计算梗死体积百分比。结果 K252 a能够改善大鼠的行为，减少梗死体积。结论 K252 a对局灶性脑缺血导致的损伤具有保护作用。
-
K252a对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用
目的 观察K252a(MLK3阻断剂)对内毒素性急性肺损伤大鼠肺病理组织学改变及生存率的影响.方法 采用尾静脉注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)复制内毒素性急性肺损伤模型.90只大鼠随机分为6组(n=15):对照组(control组)、LPS 组、K252a 50 μg/kg组(K50组)、K252a 75 μg/kg组(K75组)、K252a 100 μg/kg组(K100组)和溶剂对照组(DMSO组).模型制备成功后6 h取肺脏进行光镜检查,观察48 h内大鼠死亡情况并比较累计生存率.结果 48 h内LPS组、K50组、K75组和K100组以及DMSO组大鼠生存率分别为6.3%、27%、72%、57%及6.7%.光镜下可见LPS组大鼠肺组织结构明显被破坏,主要表现为肺泡内出血、肺间质水肿、肺泡萎陷以及肺组织内大量炎性细胞浸润.与LPS组相比,预先应用K252a组肺组织的损伤程度较轻微、肺间隔轻度增宽、无明显出血、少量炎性细胞浸润,尤其K75组,减轻程度明显.结论 K252a延迟LPS大鼠死亡时间,并呈现剂量依赖性,75 μg/kg K252a剂量可以明显提高其生存率.并可改善内毒素性急性肺损伤大鼠肺脏的病理组织学结果.
-
DAPT与K252a联用体外抑制人脑胶质瘤U251MG细胞的生长
目的 探讨Notch信号抑制剂(2S)-N-N-(3,5-氟苯乙酰基)L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)与神经营养素受体高亲和力的酪氨酸激酶受体家族(Trks)阻断剂K252a联用对人脑胶质瘤U251MG细胞的抑制作用.方法 应用DAPT和K252a单独或联用处理U251MG细胞,噻唑蓝比色实验检测细胞的活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测p-TrkA、JNK、p-JNK、Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Bcl-xL等蛋白的表达.结果 DAPT和K252a均能呈时间与剂量依赖性抑制体外胶质瘤细胞的活性.K252a 200、100和50 nmol/L与DAPT 2.5μmol/L联合用药24、48和72 h的细胞活力均低于单独使用K252a或DAPT(P＜0.05).两药联用可以增加sub-G1期细胞,即促进细胞凋亡.与K252a 100 nmol/L或DAPT 2.5 μmol/L单用比较,K252a100 nmol/L与DAPT 2.5 μmol/L联用降低了p-TrkA的量,对于JNK的表达基本没影响,但可增加p-JNK的表达.可活化Caspase-3和Caspase-9,同时减少Bcl-xL的表达,但对Bax和Bcl-2的表达基本没影响.结论 DAPT能抑制U251MG的细胞活性.联合DAPT用药能增强K252a对人脑胶质瘤细胞U251MG的毒性.
-
NGF对人视网膜血管内皮细胞体外成管作用的影响
目的 探讨神经生长因子(nerve growth factor, NGF)对人视网膜血管内皮细胞(human retinal vascular endothelial cells, HRVEC)体外形成毛细血管管腔的影响.方法 20g·L-1胰蛋白酶消化人眼球视网膜组织,内皮细胞培养液培养HRVEC,第Ⅷ因子相关抗原抗体DAB染色法及荧光染色法进行HRVEC的组织化学鉴定.取第3代HRVEC接种于铺有基质胶(Matrigel)的24孔板(每孔200×103个细胞),分为100μg·L-1HGF、100 μg·L-1NCF+200nmol·L-1K252a、50 μg·L-1碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、50μg·L-1bFGF+200 nmol·L-1K252a和对照组(人内皮细胞培养液)共5组,1 h后各组依次添加各种培养液200 μL培养12 h后观察照相,分析比较5组新生毛细血管结构及面积.结果 接种后8 d左右梭形HRVEC细胞铺满培养瓶,第Ⅷ因子相关抗原鉴定阳性;测量5组新生毛细血管面积依次为:(2.76±0.31)mm2、(1.79±0.62)mm2、(2.99±0.58)mm2、(2.86±0.61)mm2、(1.41±0.69)mm2;100μg·L-1NGF、50μg·L-1bFGF组HRVEC均形成完整的管状结构,小管面积均明显大于对照组(均为P<0.05);100μg·L-1NGF+200nmol·L-1K252a组小管结构完整性被打破,小管面积小于100μg·L-1NGF组(P<0.05);50μg·L-1bFGF+200nmol·L-1K252a组小管面积、结构与50μg·L-1bFGF组比较无明显改变(P>0.05).结论 NGF可在体外促进HRVEC形成新生毛细血管管腔,K252a可抑制NGF促进HRVEC形成新生毛细血管管腔的作用,但k252a不能阻断bFGF的作用.
关键词： 神经生长因子 人视网膜血管内皮细胞 基质胶 k252a -
阻断TrkB-BDNF信号传导通路对神经母细胞瘤细胞生长及凋亡的影响
目的 脑源性神经生长因子(BDNF)和其酪氨酸激酶受体B(TrkB)与神经母细胞瘤(NB)细胞的化疗耐药及恶性预后密切相关.该研究探讨阻断TrkB-BDNF信号传导通路后,NB细胞对化疗药物敏感性的变化.方法 常规培养SH-SY5Y NB细胞,用nM浓度全反式维甲酸(ATRA)诱导TrkB高表达,加人BDNF、化疗药顺铂(CDDP)和特异性酪氨酸酶抑制剂K252a处理.MIT实验方法 检测应用K252a前后细胞的存活率的变化;同时应用Western-blot方法 检测应用K252a前后TrkB的磷酸化水平的变化;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率;透射电镜(TEM)观察凋亡细胞的形态与结构.结果 ATRA+BDNF+CDDP组细胞的存活率及凋亡率与对照组相比,差异无显著性(P>0.05).而经K252a处理后,细胞对顺铂的敏感性增加,细胞的存活率明显降低,凋亡率明显升高,差异有显著意义.Western-blot分析显示K252a能够阻断TrkB的磷酸化.结论 阻断TrkB-BDNF信号传导通路可提高NB的化疗敏感性,逆转耐药.
关键词： 神经母细胞瘤 TrkB-BDNF信号传导通路 k252a 细胞株 -
神经营养因子酪氨酸激酶受体B对人永生化成骨细胞hFOB1.19恶性转化细胞体外侵袭力的影响
目的 研究神经营养因子酪氨酸激酶受体B(neurotrophic tyrosine kinase receptor B,TrKB)对恶性转化人永生化成骨细胞hFOB1.19体外侵袭力的影响,探讨TrKB在骨肉瘤侵袭和转移机制中发挥的作用.方法 RT-PCR和免疫荧光细胞染色检测hFOB1.19恶性转化细胞和SaOS-2骨肉瘤细胞中TrKB的mRNA和蛋白表达水平;进一步研究hFOB1.19恶性转化细胞中TrKB的功能,处理组hFOB1.19恶性转化细胞加入特异性酪氨酸激酶抑制剂K252a处理24 h,非处理组加入DMSO作对照,倒置相差显微镜下观察细胞形态;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;actin免疫荧光细胞染色检测细胞微丝骨架.结果 TrKB在hFOB1.19恶性转化细胞中mRNA和蛋白表达水平均明显高于SaOS-2骨肉瘤细胞(P＜0.05);K252a处理组hFOB1.19恶性转化细胞和未处理组相比,细胞变圆、聚集甚至发生融合,侵袭能力明显减弱(P＜0.01),微丝回缩变短,排列紊乱.结论 人永生化成骨细胞hFOB1.19恶性转化细胞中TrKB的高表达可促进该细胞的体外高侵袭力;该受体被阻断后,可能通过改变细胞微丝骨架结构从而降低细胞的体外侵袭力;TrKB可能在骨肉瘤侵袭和转移机制中起着促进作用.
-
C-Met抑制剂对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用
目的:探讨C-Met抑制剂K252a对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用.方法:取原代培养人晶状体上皮细胞加入HGF、HGF+K252a,以DMEM为对照,应用四唑盐法(MTT法)观察K252a对晶状体上皮细胞生长的抑制作用,蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测K252a对Bcl-2,Caspase-3蛋白表达的影响.结果:HGF(50nmol/L)+K252a(30nmol/L)组与对照组光密度值无显著差异(P＞0.05),Bcl-2和Caspase-3的表达水平变化都不明显.结论:c-Met抑制剂K252a对人晶状体上皮细胞增殖有抑制作用.
