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ACE基因mRNA表达与高血压病的关系
目的:探讨血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性在国人汉族高血压病(EH)发生发展中的作用.方法:应用聚合酶链反应技术(PCR)、核酸探针杂交、酶联免疫技术的方法,测定81例中国汉族高血压病人、30例正常人的ACE基因插入/缺失(I/D)多态性的mRNA定量及DNA定性分析;同时用比色法测定血清ACE水平.结果:①正常人DD、ID、II基因频率分别为0.17、0.6和0.23.②EH组及EHⅡ期、Ⅲ期组ACE基因型分布与正常人相比差异均有显著性(P＜0.05),其DD型频率分别为0.42、0.46和0.32,均显著高于正常人(P＜0.05);D等位基因频率(0.49)高于对照组(0.23)(P＜0.05).③EH组Ⅱ期、Ⅲ期基因型及等位基因频率分布之间差异无显著性.④mRNA定量分析提示D等位基因的mRNA表达量明显高于Ⅰ等位基因的mRNA表达量(P＜0.001),二者均较正常对照组明显增高(P＜0.01).⑤高血压组血清ACE水平明显高于对照组(P＜0.001),其基因型与血清ACE水平的关系为DD＞ID＞II.结论:ACE基因缺失多态性与国人汉族EH的发病可能有一定相关性;循环ACE活性与基因缺失多态性相关.
关键词： 高血压 ACE基因I/D多态性 mRNA定量 -
小鼠间充质干细胞三系分化中SOX9与Ⅱ型胶原mRNA的定量
背景：研究表明，软骨中的主要成分Ⅱ型胶原的基因-Col2a1在软骨细胞中的表达与SOX9的浓度呈剂量依赖正相关关系。
目的：通过成骨、成软骨、成脂肪诱导干细胞分化，分析3种分化过程及不同时期的SOX9与Ⅱ型胶原 mRNA含量的变化，探讨SOX9在不同时空分布的表达规律及与Ⅱ型胶原的相关关系。
方法：取4周龄昆明小鼠骨髓间充质细胞，体外培养得到间充质干细胞并传达至第3代，对间充质干细胞进行流式细胞仪鉴定细胞表型，共分3组每组设3个时间段，通过成骨、成软骨、成脂肪3种诱导培养液对3组细胞进行诱导，另设不进行诱导的细胞作为对照组。分别在诱导3，7，14 d后收集提取细胞的总RNA，通过RT-PCR进行SOX9与Ⅱ型胶原的mRNA定量检测，同时对诱导后的细胞进行染色、免疫荧光染色，观察其分化状态及相关统计分析。
结果与结论：第3代骨髓间充质干细胞生长良好，流式细胞仪鉴定细胞表型证实为干细胞，对诱导后细胞进行染色、免疫荧光染色结果证实细胞分化为骨、软骨、脂肪细胞。经RT-PCR检测，在3组诱导分化细胞中SOX9 mRNA 含量由高到低分别是成软骨、成骨、成脂肪，Ⅱ型胶原 mRNA 含量由高到低分别是成软骨、成脂肪、成骨。在成软骨分化中SOX9在3，7 d表达不断升高，14 d呈下降趋势。Ⅱ型胶原在3，7，14 d均逐渐升高。在成骨分化中SOX9 mRNA含量随着时间推移而增加，而Ⅱ型胶原则随着时间推移而不断降低。在成脂肪分化中SOX9 mRNA表达与对照组比较差异无显著性意义(P >0.05)；而Ⅱ型胶原的表达没有规律可循，时间点的延伸及检测未观察到。结果提示，SOX9在软骨分化中作用优于成骨、成脂肪组，且软骨分化中SOX9与Ⅱ型胶原存在相关性，可能在软骨分化的早期Ⅱ型胶原随着SOX9的变化而变化；且软骨分化和成骨分化过程中SOX9可能起到了一个互相协调促进平衡的关键作用。 -
构建cRNA作为标准曲线的实时RT-PCR检测方法
目的建立一种新的基于LightCyclerTM技术,并通过构建cRNA标准曲线来对目的基因进行定量实时RT-PCR的检测方法.方法以T7 RNA聚合酶体外转录合成带有目的片段的cRNA作为标准品,并与样本同时进行反转录和PCR扩增,用此方法来检测目的基因在结直肠组织中的表达.结果采用cRNA标准品制作的标准曲线具有较好的线性关系(r＞0.99),而且在每次实验中都能取得较好的扩增效率,CEA与GAPDH的扩增效率分别大于88.7%和87.4%.结论此方法能较为准确的对组织中的目的基因表达进行定量检测.
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基因重组构建AFP mRNA的real time RT-PCR标准定量模板
目的:构建AFP mRNA的real time RT-PCR标准定量模板.方法:提取肝瘤细胞株BEL7402细胞总RNA,进行RT-PCR扩增并纯化AFP基因片段,与PMD-18T载体连接构建重组质粒.结果:重组质粒的阳性克隆效率为81.8%,经酶切鉴定,目的基因片段已插入PMD-18T载体内.结论:成功构建了AFP mRNA的标准定量模板,可应用于该基因的real time RT-PCR定量检测.
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Real time RT-PCR定量检测AFP mRNA表达水平方法的建立
目的建立realtime逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AFP mRNA表达水平方法.方法提取BEL7402细胞总RNA,进行RT-PCR扩增并纯化AFP基因片段,构建重组质粒,建立real time RT-PCR检测AFP mRNA表达水平方法.结果重组质粒的阳性克隆效率为81.8%,经酶切鉴定,目的基因片段已插入PMD-18T载体内,得到realtime RT-PCR动力学曲线.结论成功建立了real time RT-PCR定量检测AFPmRNA表达水平方法.
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关于定量PCR技术中模板使用浓度的研究
目的 研究定量PCR模板使用浓度对产物量的影响,对如何改善定量PCR技术进行一些探讨.方法 分别用1×浓度和1/10×浓度逆转录产物(cDNA)进行递增量的梯度PCR反应(0.5 μL、1μL、2μL、4μL),观察其不同量之间变化的灵敏性；进一步增大样本量,来观察这两个浓度级别分辨两倍量差距(1μL和2μL)的能力.结果 在梯度实验中,1/10×浓度的模板表现出了明显的线性关系(R2=0.9105),即产物量随模板使用量的增加而增加,而1X浓度的模板却没有表现出来(R2=0.2488).此外,1/10×浓度的模板有效的区分出了两倍量的差距(1μL组和2 μL组之间,t=3.329,P＜ 0.05)而1x浓度的模板却没有.结论 进行定量PCR时,不同的模板浓度对PCR产物量有一定影响的；选择适当的模板浓度是十分必要.
