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博莱霉素致小鼠肺纤维化中解整合素-金属蛋白酶17表达水平的研究
目的 观察博莱霉素致小鼠肺间质纤维化中解整合素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase-17,ADAM17)表达水平变化与转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)之间的相关性,以阐明肺纤维化的发病机制.方法 60只小白鼠随机分为6组,每组10只.正常对照组经气管内一次性注入0.9％氯化钠注射液(5 mg/kg).模型组5组分别为注射博莱霉素3d、7d、14 d、21 d、28 d组,经气管内一次性注入博莱霉素(5 mg/kg),分别在规定的时间点取肺组织,通过Masson胶原染色评价肺纤维化的程度,用免疫组织化学染色和蛋白质印迹(Western blotting)方法检测ADAM17和TGF-β1在肺组织的蛋白水平表达,RT-PCR检测ADAM17和TGF-β1mRNA的表达.结果 博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型成功,模型组病理呈不同程度的胶原沉积和成纤维细胞增生.小鼠纤维化程度自7d组开始均高于正常对照组(P＜0.01).免疫组化结果示,TGF-β1、ADAM17在对照组呈弱表达,模型组表达量高于对照组(P＜0.01),且14 d时表达量高.Western blotting和RT-PCR结果与免疫组化结果一致.相关性分析结果示,TGF-β1、ADAM17在免疫组化、Western blotting和RT-PCR中的相关系数r分别为0.777、0.808、0.906(P＜0.01),表明二者呈正相关.结论 ADAM17在博莱霉素致小鼠肺间质纤维化过程中表达水平上调,ADAM17可能通过上调TGF-β1发挥致纤维化的作用.
关键词： 肺纤维化 博莱霉素 解整合素-金属蛋白酶17 转化生长因子-β1 -
解整合素-金属蛋白酶17在肺泡上皮细胞间质转化中的作用研究
目的：探讨解整合素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM 17)过表达和抑制在转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)介导的A549细胞上皮向间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition， EMT)过程中的作用，以进一步揭示肺纤维化的机制。方法将A549细胞分为空白对照组、TGF-β1组、PMA(ADAM 17激活剂)组和TNF484(ADAM 17抑制剂)组。各组细胞培养36 h后，应用倒置相差显微镜观察各组细胞形态，Real-time PCR和Western blotting分别检测ADAM 17、上皮及间质细胞标记物在mRNA和蛋白水平上的表达情况。结果镜下观察发现未诱导的A549细胞呈鹅卵石形态，排列比较紧密；经TGF-β1诱导后，细胞形态伸长，出现伪足，排列较松散，细胞与细胞之间的紧密连接消失。Real-time PCR和Western blotting检测结果均显示ADAM 17在PMA组高表达，而在TNF484组低表达，差异有统计学意义；上皮细胞标记物E-cadherin在空白对照组和TNF484组高表达，间质细胞标记物Vimentin在TGF-β1组和PMA组高表达，差异同样有统计学意义。结论 ADAM 17的过表达有助于TGF-β1介导的A549细胞EMT进程，提示ADAM 17可作为肺纤维化的标记物之一。
关键词： 上皮细胞间质转化 解整合素-金属蛋白酶17 肺纤维化 -
靶向ADAM17基因RNA干扰慢病毒载体的构建及慢病毒包装
目的 构建靶向ADAM17基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体及包装慢病毒.方法 根据人ADAM17mRNA序列设计4个靶序列,合成4对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列；将以上5对寡核苷酸序列退火后连入pLVTHM质粒,经酶切和测序鉴定.将重组慢病毒质粒转染至A549细胞,以Real-time PCR检测A549细胞中ADAM17 mRNA表达.将干扰效果佳的质粒载体和包装质粒共转染至293T细胞,包装产生病毒颗粒.以流式细胞术检测重组慢病毒的滴度.结果 酶切和测序证实干扰靶序列已被准确克隆到pLVTHM质粒载体.pLVTHM-ADAM17-siRNA1-4均可显著抑制A549细胞ADAM17 mRNA的表达,其中pLVTHM-ADAM17-siRNA4的抑制效果佳.LV-ADAM17-siRNA4重组慢病毒的滴度为2.16×108 TU/ml.结论 成功构建了靶向人ADAM17基因RNAi慢病毒载体及包装了重组慢病毒.
关键词： 解整合素-金属蛋白酶17 RNA干扰 慢病毒 -
慢病毒介导的解整合素-金属蛋白酶17 RNA干扰对气道上皮细胞MMP-9表达及NF-κB活性的影响
目的：探讨脂多糖( LPS)诱导的气道上皮细胞基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的TNF-α/NF-κB信号转导机制及慢病毒介导的解整合素-金属蛋白酶17( ADAM17) RNA干扰( RNAi)对MMP-9表达的影响。方法构建ADAM17 siR-NA慢病毒载体、包装重组慢病毒。以NF-κB抑制剂( pyrroli-dine dithiocarbamate, PDTC)或TNF-α拮抗剂( etanercept)预处理HBE4-E6/E7细胞,以LPS刺激HBE4-E6/E7细胞24 h。以重组慢病毒感染HBE4-E6/E7细胞72 h后,以LPS或TNF-α刺激HBE4-E6/E7细胞24 h。以半定量RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达；以酶联免疫吸附试验检测TNF-α蛋白含量；以Western blot检测MMP-9蛋白表达；以凝胶阻滞分析实验检测NF-κB活性。结果 LPS或TNF-α刺激均明显增加HBE4-E6/E7细胞MMP-9 mRNA 和蛋白表达及 NF-κB 活性( P <0．05)；etanercept和PDTC均明显抑制LPS诱导的MMP-9表达及NF-κB活性( P<0．05)。慢病毒介导的ADAM17 RNAi明显降低LPS诱导的HBE4-E6/E7细胞上清液中TNF-α蛋白含量( P<0．05),亦明显降低 MMP-9 mRNA 和蛋白表达及NF-κB活性( P <0．05),但不能降低 TNF-α诱导的 MMP-9 mRNA和蛋白表达及NF-κB活性( P>0．05)。 PDTC明显抑制TNF-α诱导的MMP-9 mRNA和蛋白表达及NF-κB活性( P<0．05)。结论 TNF-α/NF-κB信号通路参与调控LPS诱导的气道上皮细胞MMP-9的表达,ADAM17通过调节TNF-α释放在其信号通路上游起到重要作用。
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脑慢性低灌注大鼠海马M1 受体、ADAM17水平变化及意义
17表达较B组明显下降(P均＜0.01).结论 脑慢性低灌注可损害老龄大鼠学习记忆能力,导致AD发生,其机制可能与海马组织M1受体及ADAM17的表达下降有关.
关键词： 阿尔茨海默病 脑低灌注 M1受体 解整合素-金属蛋白酶17 -
miR-330-5p负性调控ADAM17基因抑制人心脏微血管内皮细胞的间质转化
目的 探讨人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)间质转化(EndMT)过程中miR-330-5p和ADAM17基因的表达,阐明miR-330-5p对EndMT的影响.方法 培养HCMEC,应用TGF-β1诱导后,利用免疫荧光化学检测CD31和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在细胞中的表达.运用生物信息学方法对miR-330-5p和ADAM17基因的配对关系进行预测.脂质体2000转染miR-330-5p模拟物后,Real-time PCR检测miR-330-5p、ADAM17和α-SMAmRNA的表达,Western blotting检测ADAM17和α-SMA蛋白的表达.结果 光镜下可见诱导后细胞由鹅卵石形态变为长梭形,免疫荧光化学显示诱导前有强烈的CD31表达,诱导后出现α-SMA的高表达.生物信息学软件TargetScan和miRanYda显示miR-330-5p和ADAM17基因二者靶向配对良好.Real-time PCR和Western blot-ting检测结果均表明过表达miR-330-5p能够降低ADAM17和α-SMA mRNA及蛋白的表达.结论 miR-330-5p通过下调人心脏微血管内皮细胞中ADAM17基因的表达,进而抑制TGF-β1诱导的EndMT.
