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三萜皂苷合成生物学元件的初步开发:三七鲨烯环氧酶编码基因克隆及表达模式分析
中药合成生物学是将合成生物学思路引入中药天然产物次生代谢途径研究的一门新兴学科,其发展初期的首要任务是进行元件的开发与标准化,建立标准化的合成生物学元件库.三七(Panax notoginseng)作为人参属重要的药用植物,具有较高的药用价值,其主要活性成分是三萜皂苷.鲨烯环氧酶(squalene epoxidase)被认为是三萜皂苷与植物甾醇次生代谢途径中的关键限速酶,是三萜皂苷合成生物学研究的重要元件之一.本研究克隆获得三七中两种类型的鲨烯环氧酶编码基因(PnSE1、PnSE2),对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR (real-time PCR)方法检测其在4年生三七不同组织部位的表达模式,以及受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理后基因的表达量变化,为实现中药合成生物学元件挖掘与开发奠定基础.PnSE1基因与PnSE2基因预测编码蛋白分别包含537和545个氨基酸,序列相似性为79％,但N端(前70个氨基酸)序列不保守.PnSE1基因在根、茎、叶、花中均有表达,以花中表达丰度高；PnSE2基因只在花中表达量显著,其余组织较弱.PnSE1基因响应MeJA诱导,诱导24 h后在叶中的表达量大；相同诱导条件下,PnSE2基因未响应诱导,表达水平无显著变化.结果表明,PnSE1和PnSE2基因具有不同的表达模式,在三七次生代谢产物合成中起不同催化作用,推测PnSE1基因参与三萜皂苷合成途径,PnSE2基因则在甾醇合成途径中起催化作用.
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太子参鲨烯环氧酶基因的克隆及其表达分析
目的 对太子参三萜类皂苷生物合成关键调控酶鲨烯环氧酶1 (SQE1)基因进行全长cDNA克隆和功能分析.方法 基于其他植物SQE基因的同源序列设计简并引物,以太子参块根总RNA为模板,RT-PCR结合RACE技术克隆太子参SQE1基因的全长cDNA,并进行生物信息学分析.利用农杆菌叶盘转化法将SQE1基因转化烟草,研究其对烟草总三萜量的影响.结果 获得太子参SQE1基因全长cDNA序列2 038 bp,该序列包含1 554 bp的开放阅读框,编码517个氨基酸,相对分子质量为5.67×104,等电点为8.8,与其他药用植物的SQE蛋白具有较高的同源性,含有FAD结合结构域和4个跨膜区域,转太子参SQE1基因的烟草的总三萜量明显高于非转基因植株.结论 首次克隆获得太子参SQE1基因的全长cDNA,该基因的异源表达可一定程度提高转基因植物的总三萜量,为阐明与应用太子参三萜类成分生物合成途径提供科学依据.
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刺五加法尼基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶基因启动子CpG岛的预测与功能验证
目的 获得刺五加法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)基因启动子的CpG岛分布情况和功能活性.方法 针对己克隆的FPS、SS、SE基因启动子序列,使用EMBOSS和Li Lab进行CpG岛预测,同时利用GUS基因作为报告基因,pCAMBIA 1301质粒作为表达载体,利用根癌农杆菌转化拟南芥进行功能验证.结果 发现刺五加FPS、SS启动子含有2个CpG岛,长度分别是520、218bp和108、103 bp,SE启动子含有3个CpG岛,长度为290、119、149 bp.FPS、SS、SE基因启动子均具有启动活性,但强度不一,SS启动子活性强.结论 研究首次获得刺五加FPS、SS、SE基因启动子区域的CpG岛分布情况,以及其功能活性,为后续进一步FPS、SS、SE甲基化分析及其在刺五加中的表达调控研究奠定了基础.
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中药三萜皂苷合成通路的生物信息学分析
目的 从系统进化学角度对中药三萜皂苷合成通路中关键酶进行生物信息学分析.方法 从NCBI数据库下载已有17种中药中的鲨烯合成酶、鲨烯环氧酶、2,3-氧化鲨烯环化酶的蛋白质全长序列,通过生物信息学软件对其进行理化性质分析、保守域分析、蛋白质三维结构预测和系统进化树的构建.结果 序列分析表明,鲨烯合成酶、鲨烯环氧酶、2,3-氧化鲨烯环化酶的蛋白质序列保守性均较高.其中鲨烯合成酶具有两个高度保守的区域——富含天冬氨酸的镁离子结合位点1和2-可作为认定鲨烯合成酶的依据;鲨烯环氧酶和2,3-氧化鲨烯环化酶的蛋白三维结构保守,无规则卷曲部分为高变区.结论 上游合成在进化中趋于保守和稳定;三萜皂苷众多类型的形成可能与下游细胞色素P450、糖基转移酶、β-糖苷酶等的修饰有关.
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药用植物中鲨烯环氧酶基因的研究进展
鲨烯环氧酶（SE）存在于内质网的微粒体中，在鲨烯转变为环氧化鲨烯的生物过程中作为生物催化剂起催化作用。而环氧化鲨烯是从鲨烯生成环阿屯醇、香树素、羊毛甾醇等的过程中重要的中间产物。SE 的活性决定了环氧化鲨烯的生物合成的效率，继而，以环氧化鲨烯作为前体的各类甾体皂苷、三萜皂苷、甾醇等化合物的生物合成也随之受其影响，后续产物的产量取决于它的含量和活性。因此 SE 被认为是甾体皂苷生物合成途径中的一个非常重要的调控酶，已在多种植物中克隆出并进行了初步功能鉴定。该文概述几个重要药用植物的 SE 基因的克隆及原核表达，为从其他药用植物中克隆 SE 基因提供一定的参考依据及方法思路。
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人参属植物鲨烯环氧酶编码基因的生物信息学分析
目的 对人参属植物的三萜皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶及其编码基因进行分子层面的分析研究.方法 从Genbank中找到目前已公布的所有人参属植物的鲨烯环氧酶基因序列信息,利用生物信息学方法对这些序列进行开放阅读框、编码氨基酸和进化关系树进行了初步的预测和分析.结果 不同物种间的鲨烯环氧酶基因在核苷酸和氨基酸平均相似性以及结构分析表明14种鲨烯环氧酶编码基因在人参属植物中是稳定的.对人参属的14种鲨烯环氧酶进行聚类分析发现可以将其分为3类.结论 通过生物信息学方法对人参属植物鲨烯环氧酶及其编码基因进行分析,可以为鲨烯环氧酶基因以及三萜皂苷途径的分子生物学研究提供理论上的依据和指导资料.
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基于基因克隆的远志鲨烯环氧酶(SE)蛋白结构及进化分析
目的 基于基因克隆对远志鲨烯环氧酶(SE)进行蛋白结构及进化分析.方法 克隆远志鲨烯环氧酶基因(SE)DNA片段,将已克隆SE基因翻译成氨基酸序列,进行蛋白结构及进化分析.结果 已克隆远志鲨烯环氧酶基因DNA片段长517bp,具有170个氨基酸,有三个特征位点:Protein kinase C phosphorylation site、N-myristoylation site与Tyrosine kinase phosphorylation site,远志SE基因与Medicago sativa和Medicago truncatula的SE基因亲缘关系较为接近.结论 已克隆远志SE基因DNA片段能够推测远志鲨烯环氧酶部分特征位点,可以进行远志SE蛋白进化分析.
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金铁锁鲨烯环氧酶基因的克隆与表达
目的:从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行生物信息学和表达分析.方法:在转录组数据分析的基础上,利用RT-PCR方法获得金铁锁SE基因的两个克隆的全长cDNA序列及进行生物信息学分析;并进行Real-time PCR实验,测定SE在不同组织中的表达量.结果:得到2条SE cDNA,SE-1全长1 642 bp,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸;SE-2全长1 552 bp,开放阅读框1 446 bp,编码481个氨基酸;构建了pEASY-E1-SE-1及pEASY-E1-SE-2重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致.Real-time PCR结果表明SE-1、SE-2基因在根中的表达量均高于茎和叶.结论:从金铁锁中成功克隆了SE基因,可为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础.
