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地非三唑的RP-HPLC法测定及其体外代谢研究
目的为研究抗早孕新药地非三唑(DL111-IT)的代谢作用机理和进一步开发利用,建立其体外代谢的RP-HPLC测定法.方法以Lichrospher ODS-C18为色谱柱,甲醇-pH 7.5磷酸盐缓冲液(70∶30)为流动相,检测波长:235 nm,流速1.0 mL*min-1,地西泮为内标,对鼠肝微粒体孵育液中DL111-IT的RP-HPLC法进行方法学研究.应用建立的方法对DL111-IT在不同来源的鼠肝微粒体中的体外代谢进行试验.结果 DL111-IT浓度在1.01～101.0 μg*mL-1呈良好的线性关系,在不同浓度下测得平均绝对回收率和相对回收率分别为(92±4)%和(100.3±1.9)%(n=5);DL111-IT在鼠肝微粒体中的代谢, β-萘黄酮组明显快于其他组.结论本法简便、准确,可用于DL111-IT的体外代谢研究.
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地非三唑与甾体激素类药物的体外相互作用
目的观察地非三唑与甾体激素类药物的代谢性相互作用,为临床合理用药提供科学依据.方法选择在临床上可能与地非三唑合用的甾体激素类药物,如米非司酮、雌二醇、醋酸甲羟孕酮、黄体酮和炔诺酮等进行试验.分别将它们与地非三唑在鼠肝微粒体中共孵育,采用反相高效液相色谱法测定孵育液中地非三唑和共孵育药物的剩余浓度或代谢产物浓度,计算代谢抑制常数值.结果地非三唑对米非司酮、雌二醇、醋酸甲羟孕酮、黄体酮以及炔诺酮的代谢抑制常数Ki分别为(201.3±1.0),(94±4),(128.7±2.2),(64±5)和(80±4)μmol·L-1;雌二醇、醋酸甲羟孕酮、黄体酮以及炔诺酮对地非三唑的代谢抑制常数Ki分别为(66.9±2.2),(60.0±2.3),(163±10)和(88±5)μmol·L-1.结论地非三唑与甾体激素类药物之间均有不同程度的代谢相互抑制作用.
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地非三唑对大鼠肝细胞细胞色素P450 CYP1A1/2的诱导作用
目的 试从mRNA表达水平阐明地非三唑对鼠肝微粒体中细胞色素P450 CYP1A1/2的诱导机制.方法 给SD大鼠腹腔注射地非三唑,采用Trizol法提取大鼠肝脏RNA,用RT-PCR测定经地非三唑处理1, 2及4 d的鼠肝中细胞色素P450 CYP1A1, CYP1A2 mRNA的表达水平.结果 地非三唑处理不同时间的鼠肝细胞中细胞色素P450 CYP1A1, CYP1A2 mRNA的表达水平比空白对照组明显增加,空白对照组CYP1A1吸光度比值为0.270±0.040, 诱导1, 2及4 d的吸光度比值分别为0.343±0.055, 0.417±0.045及0.603±0.083;空白对照组的CYP1A2吸光度比值为0.613±0.189, 而诱导1,2及4 d的吸光度比值分别为1.510±0.226, 3.057±0.518及4.120±0.458.随着诱导时间的增加,细胞色素P450 CYP1A1及CYP1A2 mRNA的表达也逐步增加,诱导时间与表达水平之间存在一定的线性关系,相关系数分别为0.9984和0.9563.结论 地非三唑对细胞色素P450 CYP1A1/2 mRNA表达具有诱导作用.
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地非三唑在鼠肝微粒体中的体外代谢
目的为了解地非三唑(Dip)在不同预处理的鼠肝微粒体中主要受何种酶代谢影响,为其临床合理应用和进一步开发利用提供科学依据.方法将Dip与6种不同诱导剂[苯巴比妥(PB)、地塞米松(Dex)、β-萘黄酮(BNF)、Dip、吡啶和空白对照]诱导的鼠肝微粒体进行体外共孵育,用氯仿终止反应,以地西泮为内标,采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定孵育后剩余的Dip的含量.结果 BNF诱导的鼠肝微粒体对Dip代谢具有强烈的催化活性,Dip诱导的微粒体的催化能力次之,PB诱导组也有一定的催化能力,其他几种诱导剂诱导的微粒体对Dip代谢能力与对照组无明显差别.测得Dip在BNF诱导的鼠肝微粒体中的Km为(60.5±1.3)μmolL-1,vm为(5.6±0.4)mmol*g-1*min-1.结论由BNF诱导的鼠肝微粒体(主要为细胞色素P450 1A)和PB诱导的鼠肝微粒体(主要为细胞色素P450 2B)在Dip的体外代谢中可能起主导作用;Dip诱导的鼠肝微粒体对其自身的代谢也起了重要作用.
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兔血浆中地非三唑(DL111-IT)高效液相色谱荧光检测方法
目的建立兔血浆中DL111-IT的高效液相色谱荧光检测法. 方法血浆样品和内标格列本脲经氯仿提取后, 选用Diamonsil ODS-C18柱(150 mm ×4.6 mm, 5 μm),乙腈-0.025 mol·L-1磷酸氢二铵缓冲溶液(磷酸调pH 5.0)(60:40, V/V)为流动相, 流速1.0 mL·min-1,荧光检测(λex＝250 nm, λem＝332 nm).结果 DL111-IT在浓度1.00～20.00 ng·mL-1范围内呈良好线性, r=0.999 6, n=5.高(20.00 ng·mL-1)、中(10.00 ng·mL-1)、低(1.00 ng·mL-1)3个质控样本平均提取回收率分别为85.3%±1.3%, 84.9%±2.7%, 85.8%±1.8%, 方法回收率分别为99.5%±0.4%, 102.1%±1.8%, 101.3%±2.4%; 日内(n=5)和日间(n=5)RSD分别低于3.0%和7.0%.血浆样品检测限为0.3 ng·mL-1(S/N=3), 定量限为1 ng·mL-1(S/N=10, RSD<7.0%).结论本法准确、灵敏、操作简便, 为DL111-IT药代动力学研究提供了方法学基础.
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地非三唑抑制血管新生作用的研究
目的 从细胞、器官、整体三个水平观察地非三唑抑制血管的新生作用.方法 细胞水平用MTT法测定地非三唑对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用;器官水平上利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管新生模型,观察地非三唑抑制CAM血管新生的情况;并在整体水平上采用家兔角膜血管新生模型,于缝线后第3d用地非三唑于结膜囊注射给药,每天观察角膜血管新生情况.结果 地非三唑能有效抑制人脐静脉EVC304细胞的增殖,其IC50根据药物作用时间的不同,维持在9～15μg·mL-1;并能使CAM新生血管明显减少甚至消失,对家兔角膜新生血管也有同样抑制作用.结论 地非三唑能抑制血管新生作用.
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地非三唑与黄酮类化合物的代谢相互作用
目的:研究地非三唑与黄酮类化合物槲皮素、山奈酚、异鼠李素和四方蒿提取物的代谢相互作用.方法:选取山奈酚、异鼠李素和四方蒿提取物作为二相代谢葡醛酸结合反应的底物,分别在空白、β-萘黄酮和地非三唑诱导的微粒体中进行体外二相代谢,采用HPLC法测定各底物的剩余量.选取槲皮素、山奈酚对地非三唑体外一相代谢进行抑制试验,采用HPLC法测定地非三唑的剩余量.结果:地非三唑诱导的鼠肝微粒体对山奈酚、异鼠李素和四方蒿提取物的二相代谢均强于BNF诱导的鼠肝微粒体(P<0.01).槲皮素或山奈酚对地非三唑的一相代谢有较强抑制作用,抑制常数分别为(12.41±0.26)μg·ml-1和 (7.97±0.08)μg·ml-1.结论:地非三唑与上述黄酮类化合物在体外会发生代谢性药物相互作用.
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地非三唑及其注射液的质量控制
目的:采用高效液相色谱法测定地非三唑及其注射液的含量,为其质量控制提供快速、有效的分析手段.方法:采用汉邦公司Lichrosper ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇-10 mmol·L-1磷酸二氢钾(pH 7.5)缓冲液(6.5:3.5)为流动相;流速1.0 mL·min-1,应用二极管阵列检测器(DAD),检测波长:235 nm,进样量:20μL.结果:地非三唑浓度在0.02～0.20mg·mL-1范围内线性关系良好(r=0.9996),平均回收率为99.98%,日内RSD为0.43%,日间RSD为1.3%,低检测量为15 ng;样品中有关物质与主成分基线分离,中间体和降解产物不干扰测定.结论:该法专属性强,结果准确,重现性好,可用作地非三唑及其注射液含量测定和有关杂质控制的方法.
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地非三唑对鼠肝微粒体中细胞色素P450的诱导作用
目的本实验通过用相同剂量地非三唑油溶液对大鼠进行不同天数的腹腔注射,观察地非三唑对鼠肝微粒体中细胞色素P450(CYP)的诱导作用.方法(1)用CYPIA与CYPIIB的两种特征性底物乙氧基异吩恶唑与7-戊氧基异吩恶唑在经不同天数地非三唑处理的鼠肝微粒体中代谢,用紫外分光光度仪直接测定代谢物异吩恶唑的生成量.从而测定乙氧基异吩恶唑-脱甲基酶(EROD)与7-戊氧基异吩恶唑-脱烷基酶(PROD)的含量,用来袁征微粒体中CYPIA与CYPIIB的活性.(2)用CYPIIIA的特征性底物地西泮与经不同天数地非三唑处理的鼠肝微粒体体外共孵育,用氯仿终止反应并提取剩余底物,用反相高效液相(RP-HPLC)内标法测定剩余底物浓度.结果不同天数地非三唑处理的鼠肝微粒体中EROD的含量比空白组有明显的增加,而且与诱导天数有良好的相关性.而PROD的含量在地非三唑组与空白组之间无明显差异.地西泮在用不同天数地非三唑处理的鼠肝微粒体中则无明显代谢,其代谢程度与诱导的天数没有相关性.结论地非三唑对CYPIA有诱导作用.
