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紫外线B辐射敏感的miR-365在皮肤鳞癌发生中的作用研究
目的 探讨紫外线(UVB)辐射敏感miR-365在皮肤鳞状细胞癌发生中的作用.方法 取对数生长期正常人皮肤角质细胞HaCaT分为对照组和照射组,照射组给予50 J/m2的UVB照射.照射后培养不同时间,分析miRNA的表达谱.实时荧光定量PCR分析HaCaT细胞和皮肤鳞癌细胞系A431、Tca8113和HSC-1的miR-365的表达.平板克隆形成实验和Transwell小室细胞运动实验分别检测细胞的克隆形成能力和体外运动能力.构建miR-365高表达的HaCaT细胞系HaC aTPre-miR-365-2.裸鼠皮下注射HaCaTpre-miR-365-2观察其成瘤能力.结果 UVB照射后,HaCaT差异表达的miRNAs共30个,其中miR-365敏感,且照后6h升高明显,为对照的6.7倍;皮肤鳞癌细胞系A431、Tca8113和HSC-1的miR-365的表达均高于HaCaT细胞(P＜0.05),其中,A431增加多,为(15.67±1.12)倍,Tca8113少,为(4.72 ±0.85)倍;抑制皮肤鳞癌细胞系miR-365的表达可以显著抑制其克隆形成能力(=13.68,P＜0.05)和体外细胞迁移能力(t=19.98,P＜0.05),而提高HaCaT的miR-365的表达则可以显著提高其克隆形成能力(t=7.11,P＜0.05)和体外细胞迁移能力(t=22.03,P＜0.05),且能够在裸鼠皮下成功地成瘤.结论 miR-365是一种皮肤鳞状细胞癌的促癌基因.
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miR-365通过靶向E2F2抑制胃癌细胞增生和肿瘤形成
目的 研究胃癌相关miR-365调控胃癌细胞增生和肿瘤发生的功能,并通过验证下游靶分子E2F2研究miR-365的作用机制.方法 采用Northern blotting法检测miR-365在小鼠各组织器官中的表达谱;real-time PCR检测miR-365在人胃癌组织中的表达变化;细胞实验和裸鼠成瘤实验研究miR-365过表达对胃癌细胞增生的抑制作用;生物信息学分析miR-365下游靶分子E2F2;构建E2F2 3'UTR野生型和突变型荧光素酶报告载体,并利用双荧光素酶活性分析检测miR-365对E2F2基因表达的调控和结合位点;Western blotting法检测miR-365对E2F2蛋白表达的调控作用.结果 miR-365在包括胃在内的多种消化道组织中表达;miR-365在人胃癌组织中表达显著下调;miR-365过表达显著抑制多种胃癌细胞的增生和裸鼠皮下的成瘤能力;E2F2是miR-365的靶分子,miR-365通过E2F2 3'UTR上的结合位点抑制E2F2的蛋白表达.结论 miR-365在人胃癌组织和小鼠胃癌模型中表达下调,并通过下游靶分子E2F2抑制胃癌细胞增生和肿瘤形成.
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p53,miR-365在紫外线诱导小鼠胚胎成纤维细胞S期阻滞中作用
目的 探讨中波紫外线(UV-B)应激下p53调控细胞周期阻滞过程中miR-365的作用.方法 用50J/m2的UV-B分别照射p53正常表达的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和p53低表达的MEF,分别在照前和照后不同时间点用流式细胞术检测细胞周期分布情况；用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹( Western blot)分别检测p53在mRNA和蛋白表达水平的改变；用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-365的表达情况.结果 50J/m2的UV-B照射后18h,p53正常表达的MEF出现S期阻滞,并在照后24h出现明显的凋亡峰,而在p53低表达的MEF中未观察到此变化；2种细胞其p53的mRNA表达水平在照后未见明显改变；p53正常表达的MEF的p53蛋白在照后1h开始升高,至12h达到峰值,24h开始下降；而在p53低表达的MEF中p53蛋白未见明显改变；UV-B照射后p53正常表达的MEF中miR-365在照后4h升高(P＜0.05),并持续到照后8h,照后12h恢复到照前水平；而在p53低表达的MEF中miR-365无明显变化.结论 UV-B照射可能通过转录后调控作用提高细胞p53蛋白水平进而发挥其诱导细胞S期阻滞的作用；miR-365参与了p53蛋白诱导S期阻滞的过程.
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p53、14-3-3σ、miR-365在UVB致HaCaT细胞G2/M期阻滞中的作用
目的:研究30 mJ/cm2的UVB照射后,HaCaT细胞周期的改变及其可能机制.方法:以人永生化上皮细胞(HaCaT)为研究对象,波长305 nm的UVB为干预因子,首先观察了HaCaT细胞在30 mJ/cm2的UVB作用后其细胞周期的变化;其次观察了UVB照后不同时间点p53蛋白、14-3-3σ蛋白表达的改变；后用miR-365高表达的HaCaT细胞分析了miR-365在UVB所致了的周期阻滞中的可能作用.结果:HaCaT细胞在30mJ/cm2的UVB作用后18h出现较明显的G2/M期阻滞；p53、磷酸化的p53以及14-3-3σ蛋白在UVB照射后均有明显升高；miR-365高表达的HaCaT细胞,14-3-3σ蛋白的mRNA表达下降,且在UVB照射后无明显改变.结论:30mJ/cm2的UVB照射可诱导HaCaT细胞发生G2/M期阻滞,p53、14-3-3σ、miR-365可能在其中发挥了重要作用.
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miR-365抑制骨肉瘤细胞增殖并促进其凋亡
目的 检测microRNA-365(miR-365)对SOSP-9607骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法 利用人工合成的miR-365模拟物以及miR-365抑制物,瞬时转染SOSP-9607骨肉瘤细胞.实时定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中miR-365的水平;流式细胞术检测SOSP-9607骨肉瘤细胞的细胞周期与凋亡;MTT法检测细胞增殖能力的变化;qRT-PCR检测细胞中KRAS的水平.结果 miR-365模拟物上调骨肉瘤细胞miR-365表达水平,抑制细胞增殖,细胞G1期增加、S/G2期减少,同时凋亡增加,KRAS基因的表达下降;miR-365抑制物下调SOSP-9607骨肉瘤细胞miR-365的表达水平,促进骨肉瘤细胞增殖,同时抑制凋亡,上调KRAS基因的表达.结论 miR-365抑制SOSP9607骨肉瘤细胞增殖并促进其凋亡,可能通过调节KRAS来发挥抑癌作用.
