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降落PCR在运动人体科学实验检测中的应用
目的:探讨在运动人体科学实验中采用降落PCR (touchdown PCR,TD-PCR)方法同时扩增多个目的基因的应用.方法:对多个运动人体学科研究的相关mRNA进行逆转录,将逆转录后的cDNA采用TD-PCR法扩增,并与常规PCR方法结果进行比较.结果:TD-PCR方法可以同时扩增多个mRNA逆转录的cDNA,可以快速、有效扩增多个目的基因.
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CAT基因突变热点区域的PCR扩增方法
目的 探讨过氧化氢酶基因突变热点区域PCR扩增方法 ,提高PCR反应的特异性和灵敏度,有助于快速检测CAT基因相关疾病.方法 从人静脉血液标本提取人血液基因组DNA,设计引物扩增特定的CAT基因片段,联合应用热启动PCR和降落PCR技术.结果 建立了重复性好,分辨率高的PCR反应体系.结论 建立了适用于CAT基因突变热点区域的PCR反应体系,有助于快速检测CAT基因相关痰病.
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猕猴结核分枝杆菌PCR检测方法的建立与初步应用
目的 建立猕猴结核分枝杆菌PCR快速检测方法.方法 根据GenBank中报道的人型结核分枝杆菌标准株H37RV全基因序列,针对其中致病性结核分枝杆菌所特有的保守区域ESAT-6设计一对引物进行Touchdown PCR反应,利用此方法对100份野生来源猕猴全血标本进行检测,并与传统的PPD实验和咽拭子抗酸染色实验结果作比对.结果 抽取33份野生来源猕猴的外周血,提取DNA进行扩增,扩增片段经纯化、回收克隆测序后用BLAST软件进行同源性对比,与GenBank中报道的序列基本相同,检测标本中有4份(4/33)为阳性,其中3份(3/33)标本与结核菌素试验和咽拭子抗酸染色试验结果相符合.结论 建立了从猴全血中直接检测猴结核分枝杆菌DNA的Touchdown PCR方法,具有敏感性和特异性高,且简便的优点.
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改良的降落PCR扩增中国地鼠目的基因
目的 优化PCR程序,尝试用降落PCR扩增中国地鼠目的 基因.方法 设计了4对引物,用普通PCR和改良的降落PCR扩增中国地鼠COX1、COX2、NADH5、NADH6部分基因.结果 普通PCR只有1对引物扩增出特异性条带,而降落PCR 4对引物都扩增出特异性条带,并与中国地鼠目的 基因大小一致.结论 降落PCR省略了常规PCR中摸索适退火温度的过程,对中国地鼠一些Tm值相近的基因可以使用降落PCR温度程序扩增,是一种行之有效的PCR方法.
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初发性和复发性生殖器疱疹患者尿道和宫颈排毒的临床研究
目的 应用降落PCR法检测初发性和复发性生殖器疱疹患者尿道和宫颈HSV排放情况.方法 对每位初发性和复发性生殖器疱疹患者均取1个拭子,采用降落聚合酶链式反应(TD-PCR)对临床标本进行鉴定.结果 共检测38例生殖器疱疹患者,男性尿道口标本28个,初发性7个,复发性21个；女性宫颈管标本10个,初发性和复发性各5个.经降落PCR方法鉴定,均为HSV-Ⅱ.初发病例与复发病例的HSV-PCR阳性率分别为83％ (10/12)和46.2％ (12/26)(x2=4.66,P＜0.05),有显著性差异.结论 初发性和复发性生殖器疱疹患者尿道和宫颈HSV排放的情况不同,初发性生殖器疱疹的排毒率高于复发性生殖器疱疹.
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一种优化的PCR方法--降落PCR扩增目的基因
目的:尝试用一种新的PCR方法--降落PCR扩增目的基因.方法:在构建人CD137-hIgG1Fc-pCDNA3融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV多聚酶YMDD变异的过程中运用降落PCR扩增目的基因.结果:扩增出的特异性条带与目的基因大小一致.结论:降落PCR省却了常规PCR中摸索适退火温度的过程,对一些Tm值相近的PCR反应可应用一套温度程序扩增,是一种行之有效的PCR方法.
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人抵抗素基因全长的体外拼接及真核表达载体的构建
目的:利用合成的寡核苷酸片段,在体外拼接人抵抗素(Resistin,Retn)基因的全长,并构建其真核表达载体.方法:根据已知抵抗素基因(GenBank:AF323081),设计并合成10条寡核苷酸片段,采用降落PCR方法进行拼接,获得预期大小的PCR产物后将其克隆入pSecTag2B载体进行测序确认.结果:降落PCR法扩增的特异条带与目的基因的大小一致.克隆载体测序结果与GenBank中已知序列完全符合.结论:降落PCR成功地拼接和扩增了人抵抗素全长基因,并构建了含有该基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础.
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长片段基因FMNL2PCR实验的体会
目的 尝试扩增长片段FMNL2基因.方法 采用巢式PCR或和降落PCR相结合的方法进行了FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT的扩增.结果 高效、特异地扩增出FMNL2基因编码区全长及FMNL2-NT、-CT片段.结论巢式PCR或和降落PCR相结合,提高了目的 基因的扩增效率和扩增产物的特异性.
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转基因大米的多重降落PCR检测方法研究
目的 建立转Bt基因大米的多重降落PCR定性检测方法.方法 本实验以转Bt基因大米为研究对象,针对大米的内源基因蔗糖磷酸合酶sps基因和转基因大米中普遍存在的外源基因CaMV35S启动子选择两对特异性引物,分别用于判断大米基因组DNA的存在及扩增体系的适用性和筛选转基因片段的存在,进行多重降落PCR扩增.分别对热循环参数和反应体系进行优化,同时考察了方法的特异性,并对市场出售的实际样品进行检测.结果 在优化的条件下,转Bt基因大米的sps基因和CaMV35S启动子均可获得有效扩增.特异性实验结果表明本法特异性高,结果稳定;所选择的市售样品均未检测出转基因成分.结论 本研究建立的转基因大米的多重降落PCR检测方法与常规PCR相比,更为快速、简便,且具有较强的特异性,可用于转基因大米的快速定性检测.
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转Bt基因稻米的降落PCR-毛细管电泳快速检测研究
目的:建立转Bt基因稻米的降落PCR-毛细管电泳快速定性检测方法.方法:转Bt基因稻米经磨碎后提取基因组DNA,对其内源蔗糖磷酸合酶SPS基因和抗虫毒蛋白Bt基因同时进行聚合酶链反应(PCR)扩增,产物用无胶筛分毛细管电泳分离、激光诱导荧光检测器检测.结果:在优化条件下,25 min内即可完成SPS和Bt基因的检测,日内精密度在2.37％ ～3.19％之间,特异性实验结果表明本法特异性较高.结论:所建立的方法快速、分离效能高、样品用量少且成本低廉,适用于转Bt基因稻米的快速鉴定.
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应用降落PCR及克隆测序检测2型糖尿病外周血白细胞胰岛素样生长因子受体IGF1R基因甲基化
目的:比较应用降落PCR(TD-PCR)及克隆测序检测2型糖尿病患者外周血白细胞中胰岛素样生长因子受体( IGF1 R)基因启动子区DNA甲基化位点的方法.方法:提取2型糖尿病患者外周血白细胞DNA进行亚硫酸氢盐处理,设计引物扩增IGF1R基因启动子区富含CG位点序列,分别行普通PCR和TD-PCR扩增,对含目的条带产物进行直接测序和克隆后测序.结果:与普通PCR扩增结果相比,TD-PCR扩增条带清晰、产物量多、二聚体少;且TD-PCR减少了对退火温度不断摸索的过程.克隆后测序峰图清晰,碱基丢失错判频率减少.结论:推荐应用TD-PCR检测亚硫酸氢盐处理的DNA甲基化位点,并进行克隆后测序.
关键词： 甲基化 降落PCR 胰岛素样生长因子1受体 2型糖尿病 测序 -
降落PCR在mRNA差异显示技术中的应用
[目的]应用降落PCR(TD-PCR)快速扩增难治性肾病综合征(RNS)与激素敏感性肾病综合征(SSNS)患者外周血单个核细胞(PBMC)表达基因并筛选差异基因.[方法]利用mRNA差异显示技术,采用TD-PCR扩增RNS、SSNS患者PBMC基因表达谱和回收的差异片段,差异片段测序后在GenBank进行同源比较.[结果]琼脂糖电泳检测TD-PCR扩增产物条带清晰,产物量和条带数量多于普通PCR,经测序和同源分析筛选的差异片段纯度较高、特异性较强.[结论]TD-PCR能为RNS、SSNS患者间差异基因的筛选提供快速可靠的方法.
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Diego血型基因分型方法的建立及西安地区多态性分布研究
目的 建立降落PCR技术检测Diego血型基因的方法,并对西安地区献血者Diego血型基因多态性分布进行分析研究,同时建立Diego稀有血型库.方法 建立了降落PCR检测Diego血型基因的方法,并采用抗-Dia和商品化基因分型试剂盒进行验证,以及基因测序做进一步确认.对西安地区1068名献血者提取基因组DNA,进行Diego血型基因分型.结果 建立了检测Diego血型基因的降落PCR方法,用此方法共检测到Di(a+b-)1例,Di(a+b+) 52例,Di(a-b+)1 015例,未检测到Di(a-b-)样本.献血者中Dia抗原的表达频率为0.049 63,Dib抗原的表达频率为0.999 06.结论 本研究成功建立了降落PCR技术检测Diego血型基因的方法,并对西安地区献血者的Diego血型进行筛查和分析,获得其多态性分布数据.
