首页 > 文献资料
-
毛细管电泳-激光诱导荧光检测分析重组人促红细胞生成素时不同荧光衍生化方法的比较研究
内源性糖蛋白人促红细胞生成素(hEPO)在控制红细胞生成方面具有重要的作用.而重组EPO(rhEPO)则是一种基因重组药物,属于高度糖基化的糖蛋白,在临床上多用于促进术后康复和体能恢复.同时,作为一种内源性激素,它对红细胞生成有特异性的刺激作用,对机体的有氧工作能力有明显的促进作用,故在一些耐力运动比赛项目中常被滥用.由于其明显的副作用,国际奥委会已将rhEPO列为违禁药物.又由于rhEPO与人体自然生成的hEPO在序列结构上儿乎没有区别,而且rhEPO的半衰期很短,在血液和尿液中的浓度非常低,所以药检难度很大.目前,国际反兴奋剂委员会的rhEPO检测方法是基于尿检和血检的综合结果.此方法虽然有效,但仍然存在一些缺点,比如rhEPO抗体的特异选择性还不是很高,费用昂贵,操作步骤繁琐、费时等等.本文采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)的方法,分别采用两种荧光衍生试剂FITC和FQ实现完整的rhEPO分子的柱前和柱上衍生化,并将两种方法的检测灵敏度和糖型分离效率与CE-UV的结果进行了比较.结果证明,FITC和FQ均可用于低浓度rhEPO的荧光标记,但过量的FITC会干扰标记rhEPO的荧光信号.采用FQ柱前标记能够提高检测灵敏度,但由于多重标记增加了标记产物的复杂性,会降低不同糖型rhEPO的分离效果.通过优化FQ柱上衍生反应条件,能够避免复杂的多重衍生,可获得高灵敏检测结果及一定程度的糖型分离结果.尽管该方法的检测灵敏度尚达不到检测血液和尿液中的rhEPO的目标,但仍可能作为rhEPO生产过程中的质量控制方法.
关键词： 重组人促红细胞生成素 毛细管电泳 激光诱导荧光检测 在线荧光标记 -
转Bt基因稻米的降落PCR-毛细管电泳快速检测研究
目的:建立转Bt基因稻米的降落PCR-毛细管电泳快速定性检测方法.方法:转Bt基因稻米经磨碎后提取基因组DNA,对其内源蔗糖磷酸合酶SPS基因和抗虫毒蛋白Bt基因同时进行聚合酶链反应(PCR)扩增,产物用无胶筛分毛细管电泳分离、激光诱导荧光检测器检测.结果:在优化条件下,25 min内即可完成SPS和Bt基因的检测,日内精密度在2.37％ ～3.19％之间,特异性实验结果表明本法特异性较高.结论:所建立的方法快速、分离效能高、样品用量少且成本低廉,适用于转Bt基因稻米的快速鉴定.
-
CEIA-LIF法在重型再生障碍性贫血患者干扰素-γ水平检测中的应用
目的:检测再生障碍性贫血(再障)患者单个CD8+T细胞内干扰素-γ(IFN-γ)的绝对含量.方法:用毛细管电泳免疫分析激光诱导荧光法对再障患者外周血单个CD8+T细胞内IFN-γ的水平进行定量检测.结果:2例重型再障(SAA)患者免疫治疗前外周血单个CD8+T细胞内IFN-γ的水平分别为(151.53±28.92)z mol和(223.72±45.23)z mol,免疫治疗后相应的降为(45.57±13.90)z mo1和(36.44±9.66)z mol,正常对照为(47.47±17.97)z mol.经统计分析,SAA患者治疗前、后及与正常对照比较差异均有统计学意义.结论:毛细管电泳免疫分析激光诱导荧光法可以检测到外周血单个CD8+T细胞内IFN-γ的z mol水平,有望成为一种新的检测方法应用于临床.
-
毛细管电泳与微流控芯片电泳快速检测粪便中腺病毒的方法建立
目的 建立粪便中腺病毒的PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光和PCR-微流控芯片电泳-激光诱导荧光快速检测方法.方法 采用试剂盒法提取粪便中腺病毒DNA,选择腺病毒六邻体基因保守区域进行PCR扩增反应.PCR产物分别用高灵敏度的SYBR Gold和SYBR Orange核酸荧光染料进行标记,在优化的毛细管电泳和微流控芯片电泳条件下分离,采用激光诱导荧光检测特异性PCR扩增产物.结果 腺病毒扩增产物在优化的毛细管电泳和微流控芯片电泳条件下可分别于9 min和6 min内完成检测.将PCR扩增产物测序,并与NCBI基因库中核酸序列比对,结果表明所选用的扩增序列特异性良好.商品化DNA Marker毛细管电泳和微流控芯片电泳对目标DNA片段bp值求得的日内精密度分别为1.14％～1.34％和1.18％～1.48％,日间精密度分别为1.27％～2.76％和2.85％～4.06％.毛细管电泳-激光诱导荧光法和微流控芯片电泳-激光诱导荧光法检测腺病毒的灵敏度分别为2.33×102 copies/mL和2.33×103 copies/mL.两种方法用于实际粪便样品测定,准确度高.结论 本研究建立的PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光和PCR-微流控芯片电泳-激光诱导荧光检测方法能够快速、灵敏、准确地检测出粪便中的腺病毒.
-
单个CD8+T细胞内IFN-γ含量的测定
目的: 建立一种新的单细胞内IFN-γ的检测方法毛细管电泳免疫分析激光诱导荧光法(CEIA-LIF).方法: 选2例重型再障(sever aplastic anemia, SAA)患者及1例正常人, 用免疫磁珠法分离纯化外周血CD8+ T细胞.将其与毛地黄皂苷反应15 min, 再与FITC-抗IFN-γ单抗(mAb)反应20 min.用CEIA-LIF法进行单个细胞的连续检测, 并用倒置显微镜及激光扫描共聚焦荧光显微镜等证实本法的可行性.结果: 纯化的CD8+ T细胞内的IFN-γ, 是在不溶膜的情况下得到全部检测.2例SAA患者外周血单个CD8+ T细胞内IFN-γ的含量, 分别为(151.53±28.92)zmol和(223.72±45.23)zmol, 高出正常对照(47.47±17.97)zmol约3～4倍(P<0.01).结论: CEIA-LIF法对单个CD8+ T细胞内IFN-γ含量的测定是可行的, 有望用于临床检测.
