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研究下颌骨侧嵴扩增的兔动物模型的建立
目的:建立下颌骨侧嵴扩增的动物模型,初探rhBMP-2/BG(recombinant human bone morphogenetic protein-2 in bioglass)下颌骨表面和缺损内扩增的可行性.方法:磨牙区唇侧骨皮质表面,预备4～6个5mm骨缺损,一侧骨皮质表面和骨缺损内放置BG/rhBMP-2,另一侧作为空白对照.术后8周大体观察、组织学检查和组织学测量.结果:观测时间内所有植入体固位良好,下颌骨表面明显扩增,材料表面骨组织覆盖;组织学观察皮质骨表面和骨缺损内新骨形成,纤维组织分割BG颗粒,大量新生骨呈编织骨样结构,与BG颗粒直接结合.部分BG颗粒已降解被新骨取代,并与骨皮质表面直接结合,残留颗粒被新骨包围,新骨形成百分比明显高于BG(P＜0.05).结论:下颌骨侧嵴扩增模型可靠、有效.
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重组rhBMP-2与生物玻璃陶瓷复合物的表面骨扩增作用研究
目的:探讨生物活性玻璃(biologically active glass, BAG)对重组人骨形成蛋白-2(recombinent human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)诱导骨形成的的影响,评价rhBMP-2/BAG复合物在兔颅骨表面的骨扩增作用.方法:在16例兔模型的颅骨骨膜下、骨皮质表面,分别植入 rhBMP-2/BAG、BAG和单纯BMP,并设空白对照组.植入后2、4、8周行组织学检查,观察植骨区的变化,并测量成骨厚度.结果:rhBMP-2/BAG的表面成骨作用比单一BAG、rhBMP-2好,其骨化过程类似于膜内化骨的直接骨形成,与骨皮质表面良好结合,新骨中可见BAG颗粒并于8周后大部分吸收,新骨形成厚度明显高于BAG组,BAG组的新骨形成厚度明显高于其他两组.结论:BAG具有骨传导性能和可吸收性, rhBMP-2/BAG复合材料将骨诱导性和骨传导性结合起来,促进骨表面的扩增,是一种有临床应用前景的骨替代材料.
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动态观察bFGF和rhBMP对牙周膜细胞增殖的影响
目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和重组人骨形成蛋白(rhBMP)分别及联合作用对人牙周膜细胞(PDLCs)增殖的影响;优选其佳显效浓度.方法选取因正畸治疗需要拔除的第一前磨牙,刮取根中1/3牙周膜组织作为标本,采用牙周膜细胞的体外培养技术,用四唑盐比色法(MTT)和酶动力学方法,动态观察bFGF、rhBMP梯度含量分别及联合作用对人PDLCs增殖的影响.结果 bFGF、rhBMP分别作用均能促进PDLCs的增殖;bFGF(10)+rhBMP(200)(佳浓度之和)促PDLCs增殖作用均较其分别作用更加显著;动态观察bFGF(10)+rhBMP(200)作用于PDLCs 1～7d,显示出连续递增的促增殖趋势.结论 bFGF、rhBMP分别作用均能促进人PDLCs的增殖,联合应用则更具有协同作用;其中bFGF(10)+rhBMP(200)为佳显效浓度
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 重组人骨形成蛋白 牙周膜细胞 -
PerioGlas/rhBMP-2用于兔下颌骨侧嵴扩增的初步实验评估
目的探讨PerioGlas(bioactive glass,BG)与重组人骨形成蛋白-2(recombinent human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)在下颌骨侧嵴扩增的可行性.方法在兔磨牙区唇侧骨皮质表面, 球钻预备4～6个5mm的骨缺损,一侧骨皮质表面和骨缺损内放置BG/rhBMP-2,另一侧作为空白对照.术后正常饮食,2、4、8周后大体观察、组织学检查和组织学测量.结果观测时间内所有植入体固位良好,没有炎性反应.下颌骨表面明显加厚.材料表面骨组织覆盖;组织学观察皮质骨表面和骨缺损内新骨形成,2周纤维组织分割BG颗粒,4周大量新生骨呈编织骨样结构,新骨与BG颗粒直接结合.8周部分BG颗粒已降解被新骨取代,并与植骨床骨皮质表面直接结合,极少量残留颗粒被新骨包围.rhBMP-2/BG的表面成骨作用比单一BG、rhBMP-2好,具有明显的骨诱导性和骨引导性.新骨形成百分比明显高于BG(P＜0.05).临床操作性能佳,易于放置,有止血作用.结论 rhBMP-2/BG可以用于下颌骨侧嵴扩增.
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重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体的构建与鉴定
背景:有研究表明骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)异源二聚体比同源二聚体的活性高20倍,但相关BMP 4/7融合基因的相关病毒载体的构建至今少有报道.目的:构建重组人BMP-4/7 融合基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体并检测其表达.方法:扩增BMP-4、7成熟肽基因;分别构建质粒pGEM-BMP-4和pGEM-BMP-7;采用DNA连接法获取BMP-4/7融合基因,克隆获得pGEM-BMP-4/7质粒,进行基因测序.AAV颗粒转染HEK293细胞,收获病毒载体AAV-BMP-4/7.用SDS-PAGE电泳检测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达.用不同感染复数的AAV-BMP-4/7转染骨髓间充质干细胞3 d,提取细胞总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和ELISA法检测融合基因BMP-4/7在骨髓间充质干细胞中的表达.结果与结论:PCR 电泳,酶切鉴定及测序结果表明,装入pSNAV质粒中的BMP-4/7 基因正确,pSNAV-BMP-4/7重组成功.RT-PCR检测到骨髓间充质干细胞BMP-4/7融合基因的转录条带,ELISA检测显示经AAV转染的骨髓间充质干细胞中BMP-4/7蛋白随着感染复数的增加表达逐渐增高(P < 0.01).结果证实,实验成功构建重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体.
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具有缓释rhBMP-2作用的仿生骨支架的构建及其体外生物活性评价
[目的]构建纳米羟基磷灰石/明胶/纤维蛋白胶/rhBMP-2三维多孔隙仿生型支架,体外研究其控制rh-BMP-2释放及其对人骨髓基质十细胞(hBMSCs)增殖、黏附及分化的影响.[方法]利用二次冷冻干燥法制备nHA/明胶/FS/rhBMP-2复合支架,电镜观察支架内部结构及孔隙率.ELISA法测定rhBMP-2体外释放情况;通过电镜观察、DNA、碱性磷酸酶(ALP)含量测定及免疫组化观察细胞在材料表面黏附、增殖及成骨分化情况.[结果]电镜观察显示支架材料具备三维孔隙性结构,孔径约为164.48μm±31.2μm,孔隙率为87.9%±2.01%;细胞在材料表面均匀黏附,生长状态良好,并有基质分泌.rhBMP-2从支架内部缓慢释放达40 d左右;细胞与材料共培养5d,其DNA与碱性磷酸酶含量显著性增高,与空白对照组相比具有统计学差异(P<0.01);与材料共培养7d,细胞骨钙素、I型胶原免疫组化染色呈强阳性,共培养14 d时四环素荧光显示钙结节形成.[结论]制备的支架材料具备与自然骨相似的三维孔隙性结构及组分,同时缓释rhBMP-2,促进BMSCs黏附、增殖及成骨分化的能力.
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pIRES-BMP2治疗牙髓暴露的实验研究
将编码骨形成蛋白2(BMP2)的cDNA克隆至真核表达质粒,构建含BMP2基因的真核表达质粒pIRES-BMP2,并导入狗牙露髓处(观察组),设生理盐水空白对照组(对照Ⅰ组)及氢氧化钙盖髓的阳性对照组(对照Ⅱ组),应用组织学方法观察发现修复性骨性牙本质(OD)形成明显,效果优于对照组.证明质粒为载体BMP转移用于治疗牙髓暴露盖髓保存牙髓活力,可在一定时间内持续产生BMP,有效增强露髓处OD的形成.
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bFGF和rhBMP对牙周膜细胞胶原酶水平的影响
目的:研究bFGF、rhBMP分别及联合作用对人牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)胶原酶Ⅱ、Ⅳ(CollagenaseⅡ、Ⅳ)水平的影响并探讨其内在相关性;优选佳显效浓度.方法:选取因正畸拔除的第一前磨牙,刮取根中1/3牙周膜组织作为标本,采用牙周膜细胞体外培养技术,免疫组化方法和图像分析技术动态观察bFGF、rhBMP梯度含量分别及联合作用对人PDLCs胶原酶Ⅱ、Ⅳ水平的影响.结果:①免疫组化定量分析, bFGF(10)浓度组能显著抑制PDLCs胶原酶Ⅳ的表达(P<0.01);rhBMP(200)浓度组能诱导PDLCs胶原酶Ⅳ的表达(P<0.05);bFGF(10)、rhBMP(25)浓度组均能显著诱导PDLCs胶原酶Ⅱ的表达(P<0.01);动态观察bFGF(10)+rhBMP(200)连续7 d对胶原酶Ⅱ、Ⅳ水平的抑制效应呈现连续的递增趋势(P<0.05).②rhBMP与人PDLCs胶原酶Ⅱ水平呈显著负相关性(P<0.01);rhBMP与人PDLCs胶原酶Ⅳ水平呈显著正相关性(P<0.01).结论:bFGF、rhBMP联合作用能更显著地抑制人PDLCs胶原酶Ⅱ、Ⅳ的表达,两者具有协同作用;其中bFGF(10)+rhBMP(200)为佳显效浓度.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 重组人骨形成蛋白 牙周膜细胞 胶原酶 -
rhBMP2对牙髓成纤维细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响
目的 了解重组人骨形成蛋白(rhBMP2)对牙髓成纤维细胞增殖活性及碱性磷酸酶(ALP)活性的影响.方法 用MMT比色法检测不同浓度rhBMP2作用下,牙髓成纤维细胞增殖活性的变化;用酶动力学方法检测不同浓度rhBMP2作用下ALP活性的变化.结果 低浓度的rhBMP2可提高体外培养人牙髓细胞的增殖活性,浓度为200ng/mL时,增殖活性达到大值,与对照组间差异有统计学意义(P＜0.05).并可促进人牙髓细胞ALP活性,呈浓度依赖性,与对照组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 rhBMP2能够促进牙髓细胞增殖和ALP活性,是牙髓细胞增殖和分化的重要因子之一.
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重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒载体的构建
目的 构建重组人骨形成蛋白4(human bone morphogenetic protein 4,hBMP-4)基因腺相关病毒载体. 方法 根据hBMP-4的基因序列设计引物,上游引入EcoR Ⅰ位点,下游引入Sal Ⅰ位点,以EX-A0242-M01-hBMP-4为模板扩增目的基因.将hBMP-4基因克隆入pUC18载体中,获得重组质粒pUC18-hBMP-4.然后用EcoR Ⅰ与Sal Ⅰ酶切pUC18-hBMP-4及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4 DNA连接酶16 ℃过夜,转化大肠杆菌DH5α感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-hBMP-4,EcoR Ⅰ/SalⅡ双酶切鉴定,并行全基因测序.转染BHK21细胞,G418筛选培养,获得抗药克隆细胞株.HSV1-rc/△UL2感染,包装此细胞株并收获病毒载体AAV-hBMP-4.行DNA点杂交法测定病毒滴度,SDS-PAGE分析判断病毒纯度.结果 PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-hBMP-4重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的hBMP-4基因正确;AAV-hBMP-4病毒的大致滴度为1.5×1012 μg/ml,分泌蛋白浓度为0.124 mg/ml,病毒载体纯度在95%以上.结论 实验获得的病毒载体滴度高、感染性好,可以满足骨组织工程的需要.
