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产黄青霉菌的诱变选育
目的:通过对产黄青霉菌的诱变选育,后达到提高青霉素生产水平.方法:用紫外线对青霉素生产菌“产黄青霉”进行诱变处理,通过定向选育获得耐高浓度青霉素的突变菌株.结论:诱变育种和其它育种方法相比,具有速度快,方法简便等优点,是抗生素产生菌选育的一种重要方法.
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产黄青霉高产菌株的选育
目的:对现生产用产黄青霉菌诱变育种以获得稳定高产菌株.方法:用化学诱变剂对菌种进行诱变育种,筛选得到的菌株通过摇瓶试验考察其产抗能力与传代稳定性.结果:选育得到的259#菌株摇瓶效价比出发菌株提高,传代三代后仍稳定.结论:通过诱变育种得到259#菌株是高产优质菌株.
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产黄青霉细胞分化与青霉素生物合成的相关性
目的：通过菌丝细胞在发酵阶段中的分化规律，去了解青霉素生物合成能力的相关性。方法：应用相差显微镜观察产黄青霉在插瓶发酵培养时菌丝形态分化的不同发育阶段。结果：它们分别完成了三个生活循环，每个生活循环中不同分化阶段的菌丝结构不同，功能也不同。结论：根据不同发酵阶段的菌丝细胞分化，可了解和掌握发酵规律。
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基于土壤农杆菌转化法高效构建高产产黄青霉tps1和tps2敲除菌株
产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)是β-内酰胺类抗生素的主要工业生产菌,高效地对其基因进行改造有利于深入研究产黄青霉的代谢机制,进而提高效价、产率和得率.高产产黄青霉基因测序的完成为菌株定向改造提供了分子基础,但是要实现快速的定向菌株改造还需要高效的基因操作系统.本试验采用土壤农杆菌(Agrobacterium)转化法高效构建了海藻糖循环途径tpsl、tps2敲除菌株P.chrysogenum-Δtpsl和P.chrysogenum-Δtps2.土壤农杆菌为高毒力的根癌农杆菌AGL-1,载体为pGreenⅡ-0179,筛选标记为博来霉素,转化对象为产黄青霉孢子.在本试验条件下农杆菌转化法的转化效率可达60％,其中发生同源重组的效率为25％.本研究为后续探究海藻糖循环在高产产黄青霉中的生理学意义提供了有益的参考.
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菌株SIPI-2013406的次级代谢产物分离纯化与菌种鉴定
利用阴离子交换色谱和反相C18色谱柱纯化菌株SIPI-2013406的代谢产物,获得纯度高于98％的化合物样品.采用质谱和核磁共振鉴定结构,推测该产物为富马酰-L-丙氨酸.产生菌经过形态和分子特征鉴定,确定菌株SIPI-2013406为产黄青霉种(Penicillium chrysogenum).
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产黄青霉penDE基因的克隆及其在带小棒链霉菌中的表达
penDE基因编码40k的酰基-CoA∶6-APA酰基转移酶(IAT),可催化产黄青霉中青霉素生物合成途径的后一步酶反应.利用RT-PCR法从产黄青霉中扩增得1.1kbp的不含内含子的penDE基因,并将其克隆至大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pUWL201,使penDE基因位于ermEp启动子的下游,再将其转化带小棒链霉菌,获得了能够表达IAT的转化子.PDAB法和抗菌活性测定表明,所表达的IAT蛋白对6-氨基青霉烷酸和苯乙酰CoA有明显的活性.
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产黄青霉vgb转化菌PTH-1嗜盐新特性研究
利用CaCl2/PEG介导的原生质体转化法获得一株有产抗能力的产黄青霉vgb转化菌PTH-1.该转化菌具有嗜盐性,必须在含有高浓度KCl的培养基中才能生长.在该盐条件下转化菌PTH-1对博莱霉素抗性稳定,具有摄氧率高、易自溶、细胞壁脆弱等特性.在高盐发酵试验中,PTH-1产抗比对照株提高14%.
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青霉素V发酵工艺探讨
青霉素V(1)是青霉素类广谱抗生素，对革兰阳性及阴性球菌具有极强的抗菌作用，至今仍是值得推广的广谱抗感染药。青霉素V钾(2)现已被卫生部列入基本药物目录和2010年重点攻关项目。 目前国内2完全依赖进口，从未见1的发酵生产工艺详细报道，我们通过长时间的摸索及实验研究，在原生产青霉素G的工艺基础上，改变配方及相关工艺，已获得连续10批发酵成功，生产水平与国外报道基本接近。1 材料与方法1.1 菌种 产黄青霉(Penicillium chrysogenum)1.2 工艺流程 同一般青霉素生产工艺［1］。1.2.1 种子培养基配方 在控制条件基本不变的情况下，改变种子培养基配方，取得较理想的结果。
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特应性皮炎患者皮肤表面真菌定植分析
目的：观察念珠菌、红酵母、青霉、曲霉在特应性皮炎患者皮肤表面定植情况，分析这4种常见致敏真菌与特应性皮炎症状严重程度的相关性。方法特应性皮炎患者50例，健康对照组20例。刮取特应性皮炎患者皮损部位及非皮损部位的鳞屑（以四肢屈侧为主）、健康对照组肘关节屈侧皮屑行真菌镜检，无1例发现菌丝或假菌丝；将皮屑标本接种于沙氏葡萄糖培养基，置25℃恒温箱内培养，发现真菌及酵母样可疑菌落，转种沙氏葡萄糖培养基斜面，获得纯培养后，根据菌落形态特征及颜色、菌落生长的快慢、镜下孢子及菌丝的特征进行菌种鉴定。结果特应性皮炎组50例，皮损表面检出念珠菌29例（58%）、红酵母17例（34%）；健康对照组20例，检出念珠菌5例（25%）、红酵母2例（10%），特应性皮炎组念珠菌、红酵母检出率明显高于健康对照组（χ2值分别为6.23、4.10，均P<0.05）。重度患者25例，检出念珠菌19例（76%）、红酵母12例（48%）；中度患者25例，检出念珠菌10例（40%）、红酵母5例（20%），重度患者皮损表面念珠菌、红酵母检出率明显高于中度患者（χ2值分别为6.65、4.37，均P<0.05）。患者组与对照组青霉、曲霉检出率差异无统计学意义。结论特应性皮炎患者皮肤表面念珠菌、红酵母定植明显高于健康对照组，且重度患者定植率高于中度患者，表明真菌定植的种类与皮肤的健康状况相关，与特应性皮炎患者症状的严重程度相关。
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展青霉素产生菌产毒性能研究
展青霉素是一种有毒的真菌代谢产物,它是一种神经毒物,且具有致畸性和致癌性[1、2].能产生展青霉素的菌有扩张青霉、展青霉、棒型青霉、土壤青霉、新西兰青霉、石状青霉、磷辞嗝埂⒚妨智嗝埂⒃不∏嗝埂⒉魄嗝埂⑤涞厍嗝埂羟埂⒕薮笄埂⑼燎购脱┌姿恳旅构?个属16种[3].我们选择了比较常见的扩张青霉、展青霉、圆弧青霉、产黄青霉、蒌地霉、棒曲霉、巨大曲霉、土曲霉共8种49株进行了产展青霉素的测定,以了解他们的产毒性能.
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青霉素生产菌——产黄青霉的蛋白质组学研究进展
青霉素是世界上早应用于临床治疗的β-内酰胺类药物,目前仍被广泛应用.产黄青霉(P.Chrysogenum)是青霉素的生产菌,其合成和调控机制已经研究得比较完善,但在其蛋白质组学方面的研究起步较晚且相对较少.本文综述了青霉素的合成与应用,以及产黄青霉的改造及其蛋白质组学的研究进展.在此基础上,重点介绍了蛋白质组学对于研究菌株蛋白表达的优势.
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发酵法制造7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸技术概述
从棒状链霉菌分离出扩环酶基因,从顶头孢中分离出扩环酶/羟化酶基因和酰化酶基因,以质粒PSELECT为基础构建插入了这些酶基因的新的质粒,将重组质粒转入产生青霉素的产黄青霉中.在适当条件下培养转化菌株,产生取代的酰基7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸,用适当的酶脱去侧链获得7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸.
关键词： 扩环酶基因 质粒 产黄青霉 7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸 -
一种快速提取丝状真菌产黄青霉DNA的方法
介绍一种快速有效的提取丝状真菌产黄青霉染色体DNA的方法.该方法以100mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、50mmol/L EDTA-Na2和2%SDS(pH9.0)为提取液,经石英砂研磨破壁,获得了较高质量的染色体DNA,该法较酶解法和氯化苄法廉价、快速、安全,且不影响其后续的分子生物学操作.
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CO差光谱法分析重组大肠埃希菌及产黄青霉中VHb的活性表达
为快速、准确检测重组菌中透明颤菌血红蛋白(VHb)的活性表达,本文改进了CO差光谱法.诱导表达VHb的重组大肠埃希菌经超声破壁、高速离心和过量的Na2S2O4充分还原后,再在试样中通入CO与VHb进行络合反应,后进行VHb的CO差光谱分析.VHb与CO络合物在419nm呈明显的吸收峰,因而可快速准确的检测VHb的活性表达.该方法亦适用于丝状真菌产黄青霉中VHb活性表达的检测.
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青霉素产生菌的原生质体融合
将细菌血红蛋白基因引入青霉素产生菌产黄青霉H-106中而获得了产黄青霉基因工程菌1M5.产黄青霉20#是一个青霉素产量高但产孢子能力偏低的生产菌.为提高产黄青霉的产量及产孢子能力,降低产黄青霉对氧的需求,我们采用原生质体融合技术,将通过UV诱变处理后检出的产黄青霉基因工程菌1M5Met-缺陷型菌株和产黄青霉20# Arg-缺陷型菌株分别用Novozyme234和CellulaseR-10(1:1)混合酶处理所得原生质体按1:1混合后加入30%聚乙二醇6000融合,产物分离纯化,得到融合株C-396#菌株,其青霉素产量和产孢子能力都有所提高,对氧的需求有所降低.
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产黄青霉形态的显微图像分析研究
利用显微图像分析法对产黄青霉的菌丝形态进行了定量研究,并统计分析了青霉素发酵过程中菌丝形态的变化规律,具体对菌丝总长度、菌丝生长期的菌丝生长单位、菌丝变异率和菌丝自溶率进行了定量分析.
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产黄青霉原生质体制备和再生影响因子分析
产黄青霉原生质体制备过程中,菌丝体佳酶解条件与原生质体释放适条件不同,菌丝体培养基含有0.05%L-天冬酰胺时,选取培养48h的菌丝体,在裂解酶(Lysing enzyme)浓度15mg/ml,0.7mol/LKCl作为渗透压稳定剂的条件下酶解,可获得大量原生质体;同时,再生培养基中含有25mmol/L Ca2+离子、上层琼脂浓度1.1%,可获得较佳原生质体再生率.
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一种新的鱼蛋白胨在产黄青霉生产青霉素中的应用
目的研究宁波海浦生物科技公司生产的鱼蛋白胨作为一种新型氮源对产黄青霉C-396生产青霉素的各环节的影响.方法在固体培养、发酵培养、生产米孢子制备时分别加入适量鱼蛋白胨,在相同条件下与原工艺配方对照比较,进行考察研究.结果采用该鱼蛋白胨用于产黄青霉C-396有利于提高生产种子的内在质量和发酵效价.结论海浦公司的鱼蛋白胨是一种较为理想的新型氮源.
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产黄青霉简单高效遗传转化法——电激转化法
目的 研究产黄青霉(P.chrysogenum)电激转化方法,建立产黄青霉快速、高效的遗传转化方法.方法 应用美国Bio-Rad电转仪,将外源DNA转化入产黄青霉菌丝中,研究了菌丝培养时间、电场强度、DNA类型等对遗传转化的影响.结果菌丝培养24h,处于旺盛生长阶段,电场强度为6000V/cm,电阻200Ω,电容20μF,环状质粒DNA较线状能获得转化效率稍高,1μg DNA获得的克隆数可达500个.结论 应用电激转化方法对产黄青霉进行遗传转化属首次报道,特别是可直接将目的片段与T-DNA相融合,转化入产黄青霉中,该方法操作简单,快速高效.
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产黄青霉原生质体融合及融合子初步分析
目的 以青霉素工业生产菌株产黄青霉为研究对象,对丝状真菌原生质体融合及其融合子进行了初步的研究.方法 通过紫外线诱变和基因转化筛选出具有不同遗传标记的2株亲本菌株,对供体亲本菌株原生质体热灭活后进行原生质体融合,并对融合子进行了分离及传代分离.结果 在选择性培养基上筛选到5株融合子,融合率为2.97×10-5,融合子分离和传代分离后产生亲本菌株分离子和异核体.结论 5株融合子均为异核体,在自然条件下融合子很难形成杂合二倍体和重组子.
