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抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单链抗体的真核表达和初步鉴定
目的 在真核细胞中表达Zhejiang Children's Hospital(ZCH)-7-2F9(简称2F9)单链抗体(scFv2F9)以获得高活性的目的 蛋白,为2F9其他类型的基因工程抗体及其免疫毒素的研究奠定基础.方法 根据pSectag2A多克隆位点、(G4S)3及scFv2F9基因序列,设计含有SfiI、EcoRI酶切位点、6xHis以及终止密码TGA的引物,采用高保真的Taq酶,通过重叠延伸拼接法(splicing by overlapextension,SOE)扩增克隆到scFv2F9基因,将扩增到的目的 基因片段克隆到pGEM T-easy载体,测序核实后再克隆到pSectag2A真核分泌型表达载体中.阳性重组质粒pSectag2A/scFv2F9转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞进行目的 蛋白的瞬时表达,将培养上清浓缩后,流式细胞术观察其对亲本单抗的阻滞效果.结果 真核分泌型表达载体pSectag2A/scFv2F9在CHO细胞中获得成功表达,其相对分子质量为31 000.亲本直标单抗2F9-FITC被真核细胞表达的scFv2F9阻滞后其阳性细胞百分数、平均荧光强度和高峰值分别下降了90.02%、63.30%和63.38%.结论 克隆到的2FgVH和2F9VL基因及构建的真核分泌型表达载体pSectag2A/scFv2F9是正确的,scFv2F9在CHO细胞中获得成功的表达,且有较高的识别和结合人CD14抗原的功能.
关键词： 单链抗体 中华仓鼠卵巢(CHO)细胞 CD14 真核 表达 -
脂质体介导Endostatin IL-12基因联合治疗移植型鼠肝癌的实验研究
目的:探讨脂质体介导Endostatin及IL-12基因联合治疗肝癌的可行性.方法:将已构建的Endostatin和IL-12真核表达载体给荷瘤BALB/c鼠瘤内注射,每周两次测量瘤体积.ELISA法检测肿瘤局部IL-12、IL-2、Endostatin含量,MTT法检测NK细胞杀伤活性,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡情况.结果:联合治疗组肿瘤体积明显小于其它各组(P＜0.05);肿瘤局部IL-12、IL-2、Endostatin的表达明显高于pVAX1空载体和生理盐水对照组(P＜0.05);NK细胞杀伤率和肿瘤细胞凋亡率分别为52.0%和48.2%.结论:联合应用Endostatin和IL-12基因可有效抑制鼠肝癌的生长.
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阿片肽结合蛋白真核表达载体的构建
目的:构建阿片肽结合蛋白的真核表达载体.方法:从人卵巢上皮组织中提取总RNA进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增出阿片肽结合蛋白(OPCML)基因片段,与真核表达载体pcDNA4/HisMaxB连接,得到重组载体pcDNA4/HisMaxB-OPCML,并酶切鉴定和测序.结果:真核表达载体pcDNA4/HisMaxB-OPCML中OPCML基因的序列和插入方向均正确.结论:本实验成功构建了阿片肽结合蛋白真核表达载体.
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真核生物启动子的鉴定方法
启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列.它对基因的表达调控起着至关重要的作用.本文对真核生物启动子的鉴定方法作了简要的总结,并对其优缺点进行了比较.
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人源化绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测
目的:构建人源化绿色荧光蛋白(humanized greenfluorescent protein,hGFP)基因的真核表达栽体pcDNA3GFP,并观察其在MDCK细胞中的表达情况.方法:以Not I切取GFP后插入真核表达载体pcDNA3,以BamH I为鉴定方向,以Lipofect AMINE PLUSTM将pcDNA3GFP转染至培养的MDCK,经G418筛选GFP阳性克隆,于荧光显微镜下观察.结果:成功构建了含hGFP cDNA的真核表达载体 pcDNA3GFP,并成功转染MDCK细胞,在荧光显微镜下阳性克隆呈绿色.结论:GFP基因可在MDCK细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记.
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结核分枝杆菌Rv2031c基因在P815细胞中的高效表达
目的 构建结核分枝杆菌Rv2031c基因的真核表达载体,并在P815细胞中高效表达.方法 应用PCR扩增Rv2031c基因,克隆人原核表达载体后进行测序,测序正确的序列克隆人真核表达载体pcDNA3.1(-);重组质粒pcDNA-Rv2031c转染P815真核细胞;以RT-PCR方法 检测结核分枝杆菌Rv2031c在真核细胞内mRNA表达,以间接免疫荧光技术检测目的 蛋白的表达.结果 Rv2031c基因成功克隆人真核表达载体pcDNA3.1(-),并可在P815细胞高效表达.结论 成功构建了真核表达重组质粒pcDNA-Rv2031c,为进一步研究Rv2031c的功能奠定了坚实基础.
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人Arresten基因真核表达质粒的构建
目的 构建人Arresten基因的真核表达质粒.方法 设计人Arresten基因引物序列,取100 mg新鲜的胎盘组织提取总RNA,采用RT-PCR法扩增Arresten基因.将获取的Arresten基因片段和pIRES2-EGFP质粒分别用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ作双酶切,将酶切产物与质粒连接,转化感受态大肠杆菌DH-5α进行真核表达.采用酶切、菌液PCR及测序的方法检测Arresten基因真核表达质粒构建的正确性.结果 经双酶切鉴定,得到1条约700 bp的片段和1条与pIRES2-EGFP空载体(5.3 kb)相近的片段,符合Arresten基因重组质粒大小.经重组质粒的菌液PCR鉴定,7组菌液均扩增出700 bp大小的扩增片段,均为阳性克隆.测序结果示,Arresten基因mRNA与GenBank中人Arresten序列完全一致.结论 成功构建了人Arresten基因的真核表达质粒.
关键词： Arresten基因 表皮生长因子受体质粒 真核 酶切 血管狭窄 -
大鼠PAX6基因真核表达载体构建及鉴定
目的：构建携带绿色荧光蛋白（ GFP）报告基因及PAX6基因的重组真核表达载体，观察其在人胚肾细胞（293FT）细胞中的表达。方法：采用聚合酶链式反应（ PCR）从大鼠脑组织中获取PAX6基因，经连接T载体测序验证正确后，与真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP经SalI/BamHI双酶切后；经T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP，用菌液PCR、SalI/BamHI双酶切及测序鉴定正确后，用脂质体法转染293FT细胞，采用倒置荧光显微镜观察GFP的表达、蛋白印迹（ Westerh blot）法检测PAX6蛋白表达。结果：重组质粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP经RT-PCR和双酶切均得到大小为1269 bp的目的条带，测序鉴定该序列与GehBahk中大鼠PAX6基因序列的同源性达100%，插入基因的大小和方向正确；重组质粒转染293FT细胞后可见GFP绿色荧光，Westerh blot显示PAX6蛋白表达。结论：成功构建了PAX6真核表达重组质粒pEF1α-PAX6-IRES-AcG-FP，能在293FT细胞中表达PAX6蛋白。
