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肺炎克雷伯菌噬菌体的分离和生物学特性
目的 以临床分离的肺炎克雷伯菌肺炎亚种为指示菌,从污水中分离出该菌的噬菌体,并对其基本生物学特性进行研究.方法 以双层琼脂法从污水中分离噬菌体,电镜观察噬菌体颗粒,紫外线诱导和丝裂霉素C诱导法鉴定是否属于溶原性噬菌体,进行一步生长实验和佳感染复数的测定,双层琼脂法测定宿主谱.结果 从污水中分离出肺炎克雷伯菌肺炎亚种的噬菌体1株.电镜下该噬菌体头部直径约为180 nm,尾长约210 nm;噬斑透明,直径4～7 mm;佳感染复数为4;一步生长曲线显示潜伏期为35 min,裂解期为40 min.裂解量为94 PFU/细胞.结论 该噬菌体属长尾噬菌体科,是裂解性噬菌体,宿主谱较窄,仅对部分肺炎克雷伯菌肺炎亚种和少量大肠埃希菌敏感.
关键词： 肺炎克雷伯菌肺炎亚种 噬菌体 裂解性噬菌体 最佳感染复数 -
铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究
目的 测定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的佳感染复数、一步生长曲线和吸附K值及交叉吸附K值等基本生物学特性.方法 按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,充分裂解细菌后,测定噬菌体滴度;以MOI＝10的比例加入噬菌体及宿主菌,进行一步生长实验;纯化PaP3颗粒,免疫家兔,获得抗血清,通过中和反应实验测定PaP3和其抗血清之间的吸附反应常数K值.同时,利用抗血清交叉中和试验确定本室分离的三株噬菌体之间的血清学关系.结果 当MOI＝0.001时PaP3感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度高;根据一步生长实验结果绘制一步生长曲线;通过血清交叉中和反应得出不同的吸附常数.结论 PaP3佳感染复数为0.001,感染宿主菌的潜伏期是20min,爆发期是60min,平均爆发量约为31,其抗血清反应的吸附常数K值为262.
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重组腺病毒载体介导人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞增殖与凋亡的影响
背景:基因工程在人类治疗恶性肿瘤的过程中起着重要作用,腺病毒是常用的基因工程载体,近年来发现乳铁蛋白在多种肿瘤的发生、发展及转移中有着重要作用,但目前对于乳铁蛋白通过腺病毒载体导入人体内的表达情况的研究报道目前还比较少.目的:观察重组腺病毒载体介导的人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞的增殖及凋亡的影响.方法:通过体外培养小鼠宫颈癌原代细胞,采用SP法分选出宫颈癌干样细胞,将构建好的载有乳铁蛋白的重组腺病毒载体人乳铁蛋白转染于宫颈癌干样细胞,分组为空白对照组、空病毒组和重组腺病毒人乳铁蛋白组.而在人乳铁蛋白感染宫颈癌干样细胞后,通过MTT法检测人乳铁蛋白感染后宫颈癌干样细胞的增殖情况,划痕实验检测宫颈癌干样细胞的迁移,通过Western blot法检测乳铁蛋白在宫颈癌干样细胞内的表达,采用Annexin V-FITC/PI法测定宫颈癌干样细胞的凋亡情况.结果与结论:与其他2组相比,重组腺病毒人乳铁蛋白组宫颈癌干样细胞增殖数量及划痕处细胞的数目减少,凋亡细胞增加(P<0.05或P<0.01).结果证实,载有乳铁蛋白的重组腺病毒载体人乳铁蛋白用于感染体外培养的宫颈癌干样细胞后,能稳定在宫颈癌干样细胞内表达,且能明显抑制宫颈癌干样细胞增殖,减少细胞迁移,并促进细胞凋亡.
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铜绿假单胞菌噬菌体PaP1生物学特性的研究
目的确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的形态大小、核酸类型、裂菌特性、佳感染复数和一步生长曲线等基本生物学特性.方法对CsC1梯度离心纯化后的噬菌体PaP1颗粒进行电镜观察;提取PaP1基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;制备PaP1的单个噬斑,观察噬斑特点;按照感染复数(MOI)分别为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,37℃160 r/min培养3.5 h后测定噬菌体滴度;加入噬菌体及宿主菌使MOI=10,37℃温育15 min后进行一步生长实验,于0时刻和每隔10min取样50 μl测定上清中噬菌体滴度.结果PaP1噬菌体头部呈多面体立体对称,直径约70 nm ,无囊膜,有一个约60 nm长的尾;PaP1噬斑直径约2mm,圆形透明;当MOI为0.01时PaP1感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度高;根据一步生长实验结果绘制出了一步生长曲线.结论PaP1属于肌尾科裂菌性噬菌体,其基因组为双链DNA分子;佳感染复数为0.01,感染宿主菌的潜伏期是20 min,爆发期是40 min,平均爆发量约为65.
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铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究
目的确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性.方法电镜观察纯化噬菌体颗粒;制备PaP2噬斑,观察其特点;提取噬菌体感染的细菌基因组,用SmaⅠ酶切,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点;测定不同感染复数,培养3.5 h后细菌/噬菌体液中的噬菌体滴度;加入宿主菌及噬菌体使MOI=10,进行一步生长实验,在0时刻和每隔15 min测定噬菌体滴度.结果噬菌体PaP2头部直径约为52nm,无囊膜,有一短尾;噬斑雾状半透明,直径约1～2 mm;被噬菌体感染的宿主菌基因组的Sma Ⅰ酶切产物带型,比未感染宿主菌的多出了1条大于噬菌体基因组的片段;当MOI=10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度高;绘制出了一步生长曲线.结论PaP2属短尾噬菌体科,是溶原性噬菌体;佳感染复数是10;感染宿主菌的潜伏期是75 min,裂解期是90min,平均裂解量是34.
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甲型流感病毒空斑形成技术的改进和应用
数为0.01,高峰期为感染后第4天.结论 该方法经改进可应用于标准病毒株及临床样本的病毒定量检测和确定流感病毒佳感染复数;低MOI感染复数易于获得高滴度流感病毒.
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棋盘试验优化噬菌体与大肠埃希菌的佳感染复数
目的 利用棋盘法测定噬菌体与大肠埃希菌在不同浓度比条件下的杀菌作用,优化传统的佳感染复数试验.方法 先利用96孔培养板纵向10倍梯度稀释噬菌体,再利用新的96孔板横向10倍梯度稀释大肠埃希菌,后用排枪分别从稀释好的噬菌体孔板和稀释好的菌液孔板中吸取100μL混合液转移到同一个新孔板中混合培养.用96点阵检测板沾取过夜培养的混合液分别接种于LB固体琼脂检测板与LB宿主菌半固体琼脂检测板上,37℃培养14h.结果 受噬菌体密度和宿主菌的数量的限制,多重性感染(multiplicity of infection,MOI)基本上在109～1010PFU/mL范围内波动,这种差异并没有本质的区别.棋盘试验3种方法都一致显示大肠埃希菌浓度低于106CFU/mL,噬菌体效价高于104pFU/mL时,呈现稳定的杀菌效果;固体检测板结果显示在呈现稳定的杀菌效果的区域内外,也有不同生长程度的菌落;半固体检测板均出现噬菌斑,表明两者作用结束后都有噬菌体存留,并生长成为充分的噬菌斑,但MOI测定时效价在一个数量级内有差异.结论 MOI试验着眼于噬菌体裂解固定数量的宿主菌的能力,棋盘试验则是着眼于对宿主菌的裂解杀灭活性;利用96孔液体培养板棋盘法可以很好的确定噬菌体与大肠埃希菌作用有效范围和低噬菌体使用浓度,可以为杀灭不同浓度宿主大肠埃希菌提供噬菌体效价参考.一般情况下细菌的浓度高达到109～1010CFU/mL,考虑到实际细菌的感染量不会太高的情况,采用105PFU/mL噬菌体能起到可靠的杀菌作用.
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Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4腺病毒载体感染小鼠的胚胎成纤维细胞的实验研究
目的 探索含Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4四个基因的腺病毒载体感染小鼠的胚胎成纤维细胞技术,为制备诱导多能干细胞(iPSCs)研究奠定基础.方法 将胎鼠躯干用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),将小鼠的胚胎成纤维细胞随机分为3组:A组:Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4腺病毒载体感染组;B组:空病毒颗粒感染组;C组:正常对照组.用目的基因感染小鼠胚胎成纤维细胞,并观察其形态变化.结果 腺病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的佳感染复数(MOI)为20-100.A组细胞变为半椭圆形,B组和C组为为长梭形.结论 含Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4四因子腺病毒载体成功感染了小鼠胚胎成纤维细胞,表明目的基因明显影响了MEF的形态,MEF细胞由长梭形变成了椭圆形或不规则形,为下一步实验奠定了基础.
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粘质沙雷菌裂解性噬菌体φSM9-3Y的分离和鉴定
目的 从医院污水中分离粘质沙雷菌噬菌体,并分析其生物学特性,为进一步研究针对耐药性粘质沙雷菌的噬菌体制剂提供依据.方法 采用双层琼脂平板法分离纯化针对粘质沙雷菌的裂解性噬菌体,观察噬菌体对宿主菌的裂解特异性,通过负染法电镜观察噬菌体的形态结构,提取噬菌体核酸进行酶切电泳,测定噬菌体的佳感染复数和一步生长曲线,SDS-PAGE电泳初步分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白.结果 从医院污水分离出7株可裂解粘质沙雷菌的噬菌体,对其中一株噬菌体(命名为φSM9-3Y)的生物学特征进行了初步研究.电镜显示噬菌体呈蝌蚪状,头部为20面体立体对称、直径约70 nm；尾部长约50 nm.φSM9-3Y的佳感染复数为1.一步生长曲线表明；φSM9-3Y的潜伏期约30 min,暴发时间70 min,暴发量为629 PFU/cell.凝胶电泳显示噬菌体基因组为双链DNA、大小约54 kb.SDS-PAGE呈现至少包括13种蛋白,相对分子质量范围在25 ～ 130 kD,其中主要蛋白的相对分子质量约为48 kD.结论 此次分离的噬菌体中SM9-3Y为裂解性噬菌体,根据形态和结构特征,粘质沙雷菌噬菌体φSM9-3Y属于有尾病毒目,肌尾噬菌体科.
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6株铜绿假单胞菌噬菌体的分离及其生物学特性
目的 分离铜绿假单胞菌噬菌体,比较其形态、裂菌特性并测定其裂解谱,根据裂解谱筛选出裂解百分比高的噬菌体,并测定其佳感染复数和体内代谢动力学等基本生物学特性.方法 取兰州市区污水样品经0.22 μm滤膜过滤,用双层琼脂平板培养法分离、纯化铜绿假单胞菌噬菌体并测定其裂解谱;纯化后的噬菌体进行扫描电镜观察;评估裂解谱后筛选出裂解百分比高的为PaP106,分别按照感染复数(MOI) =10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7比例加入PaP106和铜绿假单胞菌共培养后测定噬菌体滴度,确定其佳感染复数;不同途径(腹腔、肌肉、皮下)给小鼠注射1×1010pfu/mL PaP106 100 μL,分别于0.5、1、3、6、12、24、36h测定小鼠血液、肝脏、脾脏组织中噬菌体的浓度,分析噬菌体体内代谢动力学变化.结果 共分离到6株形态不同的铜绿假单胞菌噬菌体,对铜绿假单胞菌耐药菌株的裂解百分比为25％-75％,其中PaP106噬菌体对铜绿假单胞菌耐药菌株的裂解百分比高(75％),PaP106噬菌体的佳感染复数为1×10-6,腹腔注射PaP106噬菌体后,其在血液、肝脏、脾脏的达峰时间短于皮下注射和肌肉注射途径.结论 在分离得到的6株铜绿假单胞菌噬菌体中,PaP106噬菌体裂解性强、裂解谱宽,腹腔注射噬菌体后血液、肝脏、脾脏的分布及达峰时间快,为今后临床治疗感染多重耐药铜绿假单胞菌提供了理论基础.
