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γ-分泌酶抑制剂对正常乳鼠心肌细胞的影响
目的 探讨Notch信号特异性阻断剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对正常乳鼠心肌细胞的影响.方法 SD乳鼠心肌细胞体外分离培养后,与不同浓度DAPT(10 μmol/L、5 μmol/L、2.5 μmol/L、1.25 μmol/L、0.625 μmol/L、0.3125 μmol/L、0.15625 μmol/L)孵育24 h,或者与DAPT(5 μmol/L)孵育不同时间(1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h),MTT法测定心肌细胞活力;Western Blotting方法测定心肌细胞Notch1受体胞内区(NICD)和Bcl-2 蛋白表达量.结果 DAPT显著抑制正常乳鼠心肌细胞的存活,同时浓度越高、时间越长,其抑制效果越明显;DAPT处理后心肌细胞NICD和Bcl-2 表达均降低.结论 DAPT可阻断Notch信号通路,抑制正常乳鼠心肌细胞的增殖,促进细胞凋亡.
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Notch信号通道对角质形成细胞中RPTP-κ的影响
目的 探讨Notch信号通路对角质形成细胞中RPTP -κ的影响.方法 采用体外细胞培养,分别激活和抑制Notch信号通道后,抽提RNA,实时荧光定量RNA检测RPTP -κ mRNA含量.结果 角质形成细胞在覆盖率为40％和80％的情况下,RPTP -κ mRNA表达量后者为前者的3.4倍(P＜0.05,n=3),Hes-1则为2.9倍(P＜0.01,n=6)；激活Notch信号通道后,RPTP -κ mRNA在1、2、4、8、24h分别是对照组的1.2、1.5、5.1(P＜0.01,n=3)、2.3(P ＜0.05,n=3)、1.1倍.而Notch信号的目的基因Hes -1的表达在上述时间点分别为对照组的1.2、1.6(P＜0.01,n=3)、2.2(P ＜0.01,n=3)、1.8 (P ＜0.01,n=3)、1.3倍；覆盖率为80％角质形成细胞RPTP -κ mRNA为40％者的2.3倍(P＜0.01,n=4).而抑制Notch信号后,则变为0.6倍(P ＜0.05,n=4).结论 ①在角质形成细胞不同覆盖率的时候,Hes -1和RPTP -κ表达量有所不同,细胞覆盖率越大,细胞越多,越需要抑制细胞生长的时候,Notch信号的下游因子Hes -1表达就越多,与之相同的是RPTP- κ这一TGF -β信号的下游因子表达同样增多；②Notch信号通道激活的时候,同时会增大其自身下游因子Hes -1的表达,同时也可增加RPTP -κ的表达；③在高覆盖率的角质形成细胞中抑制Notch,本该出现升高的RPTP -κ表达反而降低了.
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Notch信号通路和miR-21在周围神经损伤修复中的交互作用机制
背景:神经损伤修复是外科临床和基础研究的主要热点之一.小间隙套管治疗周围神经损伤的作用在前期研究中已经得到证实,但详细机制未能明确.同时Notch信号通路和微小RNA系统逐渐成为该领域的潜在热点,但二者的相关作用尚未得到明确报道证实.目的:观察携带骨髓间充质干细胞的小间隙套管对周围神经损伤的治疗作用,探究Notch信号通路和miR-21在治疗过程中的相互作用关系.方法:体内实验中制造SD大鼠喉返神经8 mm缺损模型,分为假手术组、小间隙组和小间隙+骨髓间充质干细胞组,治疗后测定电生理结果,Western blot测定Notch信号通路和微小RNA表达情况.体外实验中在小间隙套管内培养骨髓间充质干细胞并行神经元方向诱导,通过改变Notch/miR21表达情况,检测神经标记物的表达情况,分析骨髓间充质干细胞活性变化.结果与结论:神经染色和肌电图结果均确认了骨髓间充质干细胞的治疗效果.在骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中,Notch信号表达明显增强,miR-21表达明显上扬.通过进一步调控两因素表达发现,人为激活Notch信号或使miR-21过表达后骨髓间充质干细胞向神经分化的能力明显增强,抑制Notch信号后,骨髓间充质干细胞神经分化能力减弱,同时miR-21的促进作用失效.发现Notch信号通路和miR-21为骨髓间充质干细胞联合小间隙套接治疗周围神经损伤可能的重要促进机制,其中Notch信号通路具有更高级别的促进或抑制作用等级.
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人源性Notch1胞内段真核表达载体的构建
目的 构建人Notch1胞内段(Notch1 intracellular domain,NICD)真核表达载体pcDNA3.1-NICD.方法 通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术从人胃粘膜上皮细胞(GES-1细胞)中获得编码NICD的cDNA,将扩增产物克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+) myc-his B,酶切和测序鉴定重组质粒.结果 RT-PCR扩增NICD基因得到2391bp片段,与预期的NICD片段大小一致.酶切和测序鉴定NICD的真核表达质粒pcDNA3.1-NICD构建成功.结论 成功构建了人Notch1胞内段真核表达质粒pcDNA3.1-NICD,为研究Notch信号通路在人胃癌发生发展中的作用机制奠定了基础.
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YC-1对 A茁寡聚体毒性的保护作用及其相关机制
目的：探讨 YC-1针对 A茁寡聚体（ADDLs）毒性的保护作用及其相关机制。方法：原代培养小鼠皮质神经元及星形胶质细胞混合培养体系，应用不同浓度 ADDLs（500 nmol/L、1滋mol/L、2滋mol/L、5滋mol/L、10滋mol/L、20滋mol/L）干预以模拟体外 AD 模型，应用 YC-1对此模型进行干预，以 CCK-8法检测细胞活力，Western blot 检测 NICD 及缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）水平，采用 real-time PCR 检测 Caspase-3 mRNA水平。结果：浓度逸2滋mol/L 的 ADDLs 干预明显降低混合培养体系细胞活力水平，并呈现浓度依赖性（＜0.01）。10滋mol/L ADDLs 持续干预4 h 显著降低细胞活力（＜0.01），YC-1可明显拮抗这种毒性作用（＜0.01）。10滋mol/L ADDLs 持续干预4 h 明显上调 NICD 及 HIF-1α水平（＜0.01），YC-1可拮抗这种提高（＜0.05或0.01）。10滋mol/L ADDLs 干预4 h 显著提高 Caspase-3的 mRNA 水平（＜0.01），YC-1可显著抑制这种上调（＜0.05）。结论：ADDLs 表现出对原代培养小鼠皮质神经元及星形胶质细胞混合培养体系的毒性作用，YC-1可发挥保护作用。
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外磁场作用下特异性磁性NICD对脊髓神经干细胞增殖与凋亡的影响
目的 研究Notch信号通路在脊髓损伤部位高表达后,对内源性脊髓神经干细胞再生能力的影响,探讨其在脊髓损伤修复中的作用.方法 构建鼠NICD(Notch intracellular domain,NICD)质粒,用经典的氧化还原法将NICD质粒结合至葡聚糖磁性纳米颗粒(dextran magnetic nanoparticles,DMN)上,参照Alivisatos和Conwell方法构建纳米化目的基因,在外磁场作用下转染体外培养鼠脊髓神经干细胞,检测转染前后细胞增殖与凋亡情况.结果 纳米化NICD-DMN转染体外培养内源性脊髓神经干细胞后,细胞明显增多,而凋亡明显减少,统计学有显著意义(P<0.05).结论 特异性磁性NICD在外磁场协助下明显促进内源性脊髓干细胞增殖,抑制其凋亡.
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姜黄素下调结直肠癌细胞Notch1信号通路研究
目的 检测Notch1信号通路中Notch intracellular domain蛋白(NICD1蛋白)在大肠腺癌组织中表达的情况;探讨姜黄素对人结肠癌细胞SW480及HT29细胞中Notch1信号通路的影响.方法 二步法免疫组化检测40例结直肠癌、31例癌旁肠组织石蜡切片中Notch1 intracellular domain蛋白(NICD1)的表达情况,通过对比人结肠直肠癌与癌旁正常肠黏膜细胞中蛋白阳性表达率判断NICD1蛋白与人结直肠癌的关系;不同浓度姜黄素(0、7.5、15、30、60 μmol/L)分别处理结肠腺癌细胞SW480和HT29细胞24 h和48 h后,Western blot法检测细胞内NICD1、Notch1及HES-1蛋白的表达情况.结果 NICD1在人结直肠癌组织中均表达,阳性率100％,癌旁肠组织中部分表达,阳性率为90.3％,但癌组织表达强度明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blot结果示姜黄素能下调人结肠腺癌细胞SW480及HT29细胞中NICD1、Notch1及HES-1蛋白的表达,有时间和剂量依赖.结论 Notch1信号通路中NICD1蛋白在结直肠癌组织中的过度表达可能与肿瘤的发生发展相关,其阳性表达的部位可能与癌组织的病理分期有关;姜黄素可能通过调控Notch1信号通路抑制结直肠癌细胞增殖.
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NICD过表达对人牙髓干细胞细胞增殖及细胞迁移的影响
目的:利用Notch1的胞内段(Notch1 intracellular domain,NICD)基因过表达载体建立稳定过表达NICD的人牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)株,观察NICD过表达对DPSCs增殖、迁移能力的影响.方法:构建含NICD过表达的慢病毒颗粒,并将其转染至DPSCs构建过表达NICD的细胞株(DPSCs/NICD);以DPSCs/NICD为实验组,正常细胞株(DPSCs/wt)和空病毒转染的空载组(DPSCs/vector)作为对照,通过RT-PCR和Western Blot检测NICD mRNA及其蛋白的表达;细胞免疫荧光观察NICD在DPSCs上的表达位置;CCK8法检测细胞的增殖情况;流式细胞技术检测细胞周期中S期的改变;Transwll检测细胞的迁移能力.结果:与DPSCs/wt组和DPSCs/vector组相比,DPSCs/NICD组的NICDmRNA及其蛋白表达水平均明显增强(P＜0.05),表达位置在胞膜、胞浆及胞核;细胞的增殖速度加快、细胞周期中S期比例升高、迁移能力增强.结论:NICD过表达使DPSCs细胞的增殖和迁移能力增强.
