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hBD3转染COS-7细胞中hBD3的诱导增强表达
目的:探讨人β-防御素3(hBD3)在其转染细胞中的表达调控规律.方法:采用10 ng/ml肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或1μg/ml的100℃下热灭活5 min的金黄色葡萄球菌分别刺激hBD3转染的COS-7细胞12 h,采用RT-PCR和Western blot方法分别检测hBD3的mRNA和蛋白表达水平变化.结果:COS-7-hBD3细胞经TNF-α和热灭活的金黄色葡萄球菌诱导12 h后,hBD3的基因转录水平明显升高,其中TNF-α诱导组表现更为突出.细胞培养上清经11%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后进行Western Blot分析,显示诱导后的细胞中hBD3的表达水平明显增高,且在TNF-α诱导组hBD3分泌水平高于热灭活的金黄色葡萄球菌菌体诱导组.结论:细菌及其产物和细胞因子可诱导hBD3表达增强.
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人β-防御素3在感染皮肤组织中表达的研究
目的:探讨人β-防御素3(human β-defensin 3,hBD3)在感染皮肤组织中的表达情况.方法:取烧伤患者感染皮肤组织和正常皮肤组织,提取总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western印迹法检测hBD3的mRNA和蛋白表达水平.结果与结论:感染皮肤组织中hBD3的mRNA和蛋白水平均显著高于正常皮肤组织.感染皮肤组织中hBD3表达增强.
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人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析
目的:在大肠杆菌系统中表达有活性的人β-防御素3(hBD3).方法:从pGEM-T-hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因,插入pGEX-4T-1构建pGEX-4T-1-hBD3融合表达载体,转化E.coli DH5α宿主菌,进行IPTG诱导,诱导菌经超声裂解后获得包涵体,包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST-hBD3融合蛋白,再经凝血酶切割,获得纯化的重组hBD3(rhBD3).对rhBD3采用小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性.结果:以与GST融合表达的方式,运用pGEX-4T-1系统在大肠杆菌中表达了hBD3,融合蛋白以包涵体形式存在.融合蛋白经凝血酶处理使rhBD3释放出来,其对金黄色葡萄球菌的MIC为4 μg/ml;对大肠杆菌的MIC为8 μg/ml.结论:采用pGEX-4T-1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3.
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人β-防御素3与结缔组织生长因子共表达重组慢病毒载体的构建及表达
目的：体外构建共表达人β-防御素3（hBD3）与结缔组织生长因子（CTGF）的重组慢病毒，并检测其对骨髓间充质干细胞（BMSC）的转染效率及表达情况。方法体外构建携带hBD3、CTGF和增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组慢病毒表达载体，测定病毒滴度。转染BMSC，确定适感染倍数（MOI）值。采用荧光显微镜和流式细胞仪检测病毒的转染效率及传代稳定性。 Western印迹检测目的蛋白的表达。结果经PCR和测序分析鉴定，成功构建了携带hBD3和CTGF基因的重组慢病毒载体Lenti-CTGF-hBD3-EGFP、Lenti-hBD3-EGFP和Lenti-EGFP，检测病毒滴度分别为3．21×108、5．80×108和1．16×109。病毒转染BMSC适MOI值为150。荧光显微镜下，转染后BMSC绿色荧光效率高；流式细胞仪检测病毒的转染效率，Lenti-CTGF-hBD3-EGFP为79．72％，Lenti-hBD3-EGFP为83．08％，Lenti-EGFP为84．43％，且都稳定遗传。 Western印迹显示目的蛋白表达成功。结论成功构建了共表达hBD3、CTGF的重组慢病毒载体，并能在BMSC中高效、稳定表达，为进一步研究hBD3与CTGF的应用奠定了基础。
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人β-防御素3基因在COS-7细胞中的表达
目的:构建人β-防御素3(hBD3)的真核表达载体,建立稳定表达hBD3的细胞株.方法:用EcoRⅠ酶切含有hBD3全长基因的pGEM-hBD3重组质粒,获得其编码区全长序列,将其连接入EcoRⅠ预处理过的pcDNA3中,转化大肠杆菌,酶切鉴定筛选出插入方向正确的转化子.采用脂质体转染法将重组pcDNA3-hBD3真核表达载体导入COS-7细胞, 用G418进行抗性筛选,用RT-PCR和Western印迹检测目的基因hBD3的mRNA和蛋白表达水平.结果与结论:构建的pcDNA3-hBD3真核表达载体转染COS-7细胞后可稳定表达hBD3的mRNA和蛋白,且蛋白主要以分泌形式存在于培养上清中.
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人β-防御素3及其衍生物的研究进展及在眼科的应用
当前细菌对抗菌药物的耐药性已成为一个亟待解决的全球性公共卫生问题,而人体天然免疫的抗菌肽防御素具有不易产生耐药的优点,在感染性疾病中具有重要意义.目前国内外鲜有大量制备生物活性防御素的报道.人β-防御素3(HBD3)是防御素家族成员,具有广谱的抗菌活性,在多种感染性疾病中有抗炎作用.HBD3对耐药菌有杀伤作用,也是惟一抗菌活性不受盐浓度影响的防御素,对眼表感染尤为有利,是抗菌药新的候选者之一.就HBD3在眼表感染中的重要性及体外进行HBD3蛋白的合成和构效关系的优化予以综述,为HBD3及其他抗菌肽的工业化制备提供基础.
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人β-防御素3与杀菌/通透性增加蛋白重组腺病毒载体及其转染C3H10T1/2细胞的构建
目的 构建人β-防御素3(hBD3)与杀菌/通透性增加蛋白(BPI)的重组腺病毒载体pAdxsi-BPI-BD3,并转染鼠胚胎间充质干细胞系(C3H10T1/2),观察融合蛋白的表达.方法 酶切原始质粒,得到BPI-BD3片段,连接到pShutde-CMV得到pShuttle-BPI-BD3,验证后将插入片段转移至pAdxsi载体构建重组腺病毒质粒,线性化后转染HEK293细胞,扩增纯化后,TCID50测定重组腺病毒滴液.pAdxsi-BPI-BD3及空载体pAdxsi(作为对照组)转染C3H10T1/2.RT-PCR、Western blot检测BPI-BD的表达;MTT法检测其对细胞增殖的影响.结果 成功构建重组腺病毒载体pAdxsi-BPI-BD3,纯化后病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml.pAdxsi-BPI-BD3转染C3H10T1/2后,RT-PCR、Western blot结果显示,BPI-BD3融合蛋白表达成功.MTT结果显示,转染的C3H10T1/2生长无明显影响(P＞0.05).结论 成功构建重组腺病毒裁体pAdxsi-BPI-BD3,且转染C3H10T1/2后可稳定表达BPI-BD3融合蛋白,为进一步研究应用抗菌肽BPI-BD3奠定基础.
关键词： 腺病毒载体 人β-防御素3 杀菌/通透性增加蛋白 -
人β-防御素3的cDNA克隆和表达载体的构建
目的克隆人β-防御素3(hβD-3)cDNA并构建其原核表达载体,为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件.方法从人扁桃体组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码hβD-3成熟肽的cDNA序列,将其克隆至pUC18载体进行序列测定,然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中.结果RT-PCR扩增得到约135bp的目的DNA片断,序列分析与GenBank中报道的编码hβD-3成熟肽的cDNA序列完全一致.结论hβD-3 cDNA的克隆和原核表达载体的构建,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础.
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盐酸米诺环素对非淋菌性宫颈炎患者HBD-1、HBD-2及HBD-3表达的影响
目的 探究并分析盐酸米诺环素对非淋菌性宫颈炎患者HBD-1、HBD-2及HBD-3表达的影响.方法 选取2016年9月至2017年9月新乡医学院第一附属医院收治的100例非淋菌性宫颈炎患者,按照随机数字表法分为对照组和试验组,每组50例.对照组患者采用交沙霉素治疗,试验组患者采用米诺环素治疗.观察并记录两组患者治疗前、治疗后2周、治疗后4周HBD-1、HBD-2、HBD-3 mRNA含量、治疗4周后疗效以及不良反应发生率.结果 治疗前后两组患者宫颈组织HBD-2、HBD-3 mRNA比较,组别与不同时间点的交互作用有统计学意义(F=10.432,P=0.002),两组患者组间宫颈组织HBD-2、HBD-3 mRNA比较,差异有统计学意义(F=9.126,P=0.003),两组患者宫颈组织HBD-2、HBD-3 mRNA不同时间点比较,差异有统计学意义(F=9.726,P=0.003),在治疗4周后试验组宫颈组织HBD-2、HBD-3 mRNA明显比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 米诺环素能有效降低非淋菌性宫颈炎患者HBD-2,HBD-3表达,改善其治疗效果,值得临床广泛推广.
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人β-防御素3融合细菌膜穿透增加蛋白在毕赤酵母中的表达
目的:探讨采用酵母表达系统进行人β-防御素3(hBD3)与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)融合表达的可行性.方法:将hBD3成熟肽基因通过Linker蛋白与BPI基因串联,克隆于酵母表达载体pPICZαB中,电转导入X-33毕赤酵母菌,经重组酵母基因组PCR和表型鉴定获得阳性克隆,对阳性克隆进行甲醇诱导表达,上清进行目的蛋白纯化和Western Blot鉴定.结果:重组载体经酶切和测序证实序列正确,重组X-33-pICZαB-hBD3-BPI克隆经甲醇诱导24 h后,上清SDS-PAGE电泳显示有目的蛋白表达,Western Blot分析表明重组蛋白抗人hBD3和BPI均阳性,该目的蛋白依次通过疏水色谱、离子交换色谱纯化,蛋白纯度达到89%.结论:采用毕赤酵母系统融合表达hBD3和BPI是可行的.
