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卡介苗对支气管哮喘大鼠气道炎症的预防治疗作用及机制研究
目的探讨卡介苗(BCG)对支气管哮喘气道炎症发生的预防治疗作用及机制.方法Wistar雄性大鼠40只随机分为对照组、哮喘组、卡介苗治疗组(BCG组)、地塞米松治疗组(地米组)、卡介苗接种组(BCG接种组),每组8只.除对照组外余各组每只大鼠于实验第1、8天腹腔注射10％卵白蛋白抗原混悬液致敏,第15天始超声雾化吸入1％卵白蛋白,20 min/d,共2周,制备哮喘气道炎症模型,各治疗组每次雾化前0.5h分别给予BCG、地米;卡介苗接种组在OVA致敏前7、3、1d,每只大鼠分别皮内注射BCG,余治疗同对照组用蒸馏水替代.各组于末次激发24 h后收集标本,检测大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)计数;HE染色观察气道重塑情况,计算机图像分析气道形态学参数,衡量气道重塑程度;ELISA法检测肺泡灌洗液及血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量;免疫组织化学(SABC)法检测E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(Fibronectin)的表达.结果哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数及嗜酸性粒细胞计数明显增多;HE染色光镜下可见哮喘组支气管管壁变厚、气道变窄,气道上皮受损肿胀,部分可见脱落;哮喘组BALF及血清中TGF-β1含量增加,上皮标志物E-cadherin表达下降,间质的标志物Fibronectin、α-SMA表达增加;BCG和地米治疗组及BCG接种组,BALF细胞总数、EOS计数及气道改变程度等较哮喘组明显减轻,BALF及血清TGF-β1含量较哮喘组下降,E-cadherin表达升高,Fibronectin、α-SMA的表达下降,与哮喘组、对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.01).结论①变应原刺激导致TGF-β1分泌增加,进而引起上皮细胞损伤间质转化是导致哮喘性气道炎症形成的重要机制之一;②卡介苗通过免疫调节作用减轻TGF-β1所致的气道上皮细胞损伤及间质转化对哮喘性气道炎症和气道阻塞的作用;③接种BCG可达到与地塞米松同样减轻气道炎症的作用.
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siRNA干扰ARK5蛋白表达对U251细胞侵袭潜能影响机制探讨
目的:探讨siRNA干扰降低腺苷酸活化蛋白激酶5(AMPK-related protein kinase 5,ARK5)表达对U251细胞侵袭潜能的影响及其机制.方法:采用蛋白质印迹法检测U251细胞中ARK5表达.应用siRNA干扰技术转染U251细胞株,并采用蛋白质印迹法检测瞬时转染后ARK5蛋白表达情况.通过体外侵袭实验检测细胞转染后侵袭能力的变化.ARK5下降后,蛋白质印迹法检测间质细胞来源的YKL-40、N-eadherin、Vimentin蛋白和调节因子Snail、Slug、Twist1和Zeb1的表达.结果:转染ARK5质粒的U251细胞ARK5表达下降.ARK5表达降低的U251细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量为22,U251对照组为41,SCR/U251对照组为42,两两比较,ARK5表达降低的实验组透膜数比两对照组少(P＜0.001),同时蛋白质印迹法结果显示,YKL-40、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量降低,与间质转化相关的转录因子仅Snail的表达降低,而转录因子Slug、Twist1和Zeb1表达无明显改变.结论:应用siRNA干扰技术降低ARK5蛋白的表达使U251细胞侵袭转移能力降低,同时YKL-40、N cadherin和Vimentin蛋白和转录因子Snail的表达量降低,提示ARK5蛋白表达降低可通过调节间质转化影响U251细胞的侵袭.
关键词： U251 SiRNA干扰 腺苷酸活化蛋白激酶5 间质转化 侵袭 -
维生素D对TGF-β1诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化的影响
目的 探讨维生素D (Vitamin D,VD)对TGF-β1诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)间质转化的影响.方法 体外培养RLE-6TN细胞,分为正常对照组(A组)、TGF-β1组(B组)、TGF-β1+VD组(C组)、TGF-β1+ICG001组(D组)、TGF-β1+VD+ICG001组(E组),分别用VD或(及)ICG001预处理细胞,24h后再加入TGF-β1,48 h后观察细胞形态,采用Westemblot检测E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(Fn)的表达.结果 镜下A组细胞贴壁生长,呈铺路石样,连接紧密;B组间隙明显增大,显著梭形变;C组、D组较B组细胞更多地呈铺路石样改变,细胞间隙有所缩小;E组细胞则大多呈铺路石样改变,间隙更小,形态接近正常组.Westemblot检测显示,B、C、D、E组的α-SMA、Fn表达量均高于A组,而E-cadherin表达量均低于A组,差异有统计学意义(P＜0.05).C、D、E组的α-SMA、Fn表达量低于B组,而E-cadherin表达量高于B组,差异有统计学意义(P＜0.05).C、D组的α-SMA、Fn表达量高于E组,而E-cadherin表达量低于E组,差异有统计学意义(P＜0.05).C、D两组的α-SMA、Fn及E-cadherin表达量比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 VD可以抑制TGF-β 1诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞间质转化.
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屋尘螨提取液对哮喘气道上皮细胞间质转化的影响
目的 探究屋尘螨提取液(House dust mite extracets,HDM)对人支气管上皮16-HBE细胞间质转化(Epithelia-mesenchymal transition,EMT)的影响.方法 以16-HBE细胞株为研究对象,分别加入HDM和转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1),应用MTT法和Western blot法,检测细胞增殖情况以及EMT过程中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.结果 ①HDM刺激后,16-HBE细胞形态改变不显著,同时对细胞增殖无显著影响;与TGF-β1联合作用后,细胞形态发生EMT变化,并且显著促进细胞增殖(P＜0.05).②HDM刺激对16-HBE细胞中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表达均无显著影响;与TGF-β1联合作用后,E-cadherin蛋白表达显著降低(P＜0.05),Vimentin和α-SMA蛋白表达升高(P＜0.05),效果较TGF-β1单独应用更为明显.结论 HDM不能直接刺激上皮细胞发生EMT改变,但可通过促进TGF-β1诱导的上皮细胞EMT改变而发挥作用.
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Nir1表达对胶质瘤细胞侵袭能力的影响
目的 探讨Nir1在胶质瘤细胞中引起向细胞间叶性转变的分子机制.方法 采用Western blot检测Nir1在不同胶质瘤细胞系中的表达;应用已构建的pcDNA3.1-Nir1质粒转染人胶质瘤H4细胞,采用Western blot法检测转染后H4细胞中Nir1、T-cadherin、间叶细胞标志物vimentin、N-cadherin及转录因子Snail、Slug、Twist1、Zeb1的表达;体外侵袭实验检测转染后细胞的侵袭能力.结果 Nir1在低侵袭力胶质瘤细胞H4中的表达低于高侵袭力胶质瘤细胞;细胞转染后,H4细胞中Nir1的蛋白表达明显增强,侵袭并穿透Matrigel胶的细胞数目明显比对照组多(P=0.00);与CCL18共同孵育72 h后细胞内vimentin、N-cadherin的表达明显增多,转录因子中只有Snail的表达明显增多而Slug、Twist1、Zeb1的表达差异无显著性.结论 在胶质瘤细胞中存在并表达Nir1蛋白,Nir1可促进胶质瘤细胞间质转化(mesenchymal transition,MT),进而调控胶质瘤细胞的运动和侵袭能力.
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SB431542抑制百草枯刺激A549细胞上皮转化机制
目的 探讨转化生长因子β(TGF-β)Ⅰ型受体激酶抑制剂SB431542对百草枯诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞株A549细胞发生上皮细胞-间质转化(EMT)的影响.方法 取A549细胞随机分为对照组、百草枯组和TGF-β1阻断组,每组3个样品.对照组细胞不予任何处理,百草枯组细胞予终浓度为20μmol/L的百草枯刺激,TGF-β1阻断组细胞予终浓度为20μmol/L的百草枯和终质量浓度为20μg/L的SB431542处理;培养5 d后收获细胞,在倒置相差显微镜和扫描电镜下观察细胞形态和表型特征,采用Transwell小室进行细胞迁移实验,采用免疫印迹法检测目标蛋白的表达,采用酶联免疫吸附实验检测TGF-β1水平.结果 倒置相差显微镜和扫描电镜下可见,对照组A549细胞正常生长;百草枯组A549细胞发生从上皮形态向间质细胞形态的转化;TGF-β1阻断组A549细胞趋于恢复上皮细胞形状.细胞迁移实验结果显示,百草枯组穿膜细胞数量分别高于对照组和TGF-β1阻断组(P<0.05).与对照组和TGF-β1阻断组比较,百草枯组A549细胞E-钙黏蛋白和紧密连接蛋白1相对表达水平均下降(P<0.05),波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、磷酸化Sma和Mad相关蛋白(p-Smad)2和p-Smad3相对表达水平均升高(P<0.05).与对照组比较,百草枯组A549细胞总TGF-β1和活化型TGF-β1水平均升高(P<0.05).结论 百草枯可通过活化TGF-β1/Smads信号通路导致A549细胞发生EMT;早期使用SB431542可通过阻断TGF-β1/Smads信号通路而抑制百草枯诱导的A549细胞EMT.
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siRNA干扰相互作用蛋白1表达抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移
目的：探讨小干扰RNA（siRNA）干扰降低PC4和SFRS1相互作用蛋白1（PSIP1）的表达对人胶质瘤U87细胞侵袭和迁移的影响并初步探讨其机制。方法采用化学合成靶向PSIP1的siRNA，脂质体法转染U87细胞，用Real-time PCR检测RNA干扰效率；Transwell侵袭实验测细胞侵袭能力；划痕实验检测其迁移能力；干扰PSIP1表达后，Western blot检测间质细胞来源的N-cadherin、β-catenin蛋白和转录因子Slug的表达。结果 PSIP1-siRNA转染胶质瘤U87细胞后，PSIP1的mRNA水平及蛋白水平明显下降（P<0.001），U87细胞侵袭和迁移能力下降，与阴性转染组及未转染组相比差异有统计学意义（P<0.001，P<0.001），Western blot显示，间质细胞来源的N-cadherin、β-catenin蛋白表达量降低，同时与上皮间质转化（EMT）相关的转录因子Slug的表达降低。结论在胶质瘤中，抑制PSIP1的表达可抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，N-cadherin、β-catenin蛋白和转录因子Slug的表达量降低，提示PSIP1可通过调控经典Wnt/β-catenin信号通路来调节Slug的表达，进而调控EMT，从而参与胶质瘤U87细胞的侵袭及迁移。
