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逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变
目的建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法,用于临床对利福平耐药的快速诊断.方法将14条特异性探针固定在尼龙膜上,通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物,与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交,杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物(四甲基联苯胺)显色判定结果.将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析.结果采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株,与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28/34和30/34.所发现突变类型依次为:第531位突变11株,第526位突变7株,第533位突变3株.未检测到第516位、第513位碱基突变.结论该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测.
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DNA 芯片--逆向点杂交技术
自1995年斯坦福大学的Schena M 和Brown PO 等[1] 发表第1篇基因表达阵列芯片以来,国内外兴起了一股微点阵(microarrays)技术--DNA芯片大浪潮.DNA芯片技术的开发与应用已在世纪末为研究AIDS、癌症过程、某些疾病诊断、基因治疗、新食品开发、新药研制及生命科学开辟了一条全新的璀璨大道.虽然,目前就预言芯片技术对于生命科学所造成的冲击可能为时尚早.但是,可以展望在不久的将来,DNA芯片技术可以取代DNA自动化测序,广泛应用于新药研制和代替PCR技术对疾病做出诊断.从这个意义上说,微点阵技术完全可以与单克隆抗体(McAb)技术、PCR技术、重组DNA技术相媲美,从而成为21世纪生命科学研究的主要手段.
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逆向点杂交技术在丙型肝炎病毒基因分型中的应用
目的:改进并应用本实验室创建的丙型肝炎病毒(HCV)基因分型方法检测HCV基因分型.方法:应用PCR-逆向点杂交技术(PCR-RBD),联合HCV的核心区和5'非编码区设计引物和分型探针,对122份HCV RNA阳性的血清标本及作为阴性对照的20份抗HCV阴性的血清标本进行基因分型,并通过与基因测序结果比较确定本方法的有效性.结果:122份受试标本共检出5种HCV基因型,分别为1a、1b、2a、3b和6a.20份阴性对照全部阴性.本研究的基因分型结果与测序分型结果一致.结论:联合HCV核心区和5'非编码区应用PCR-RBD技术可以准确有效地进行HCV基因分型,适用于常规临床检测与流行病学研究.
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乙型肝炎病毒逆向点杂交基因分型法建立及应用
目的利用逆向点杂交技术建立乙型肝炎病毒(HBV)基因分型新方法,通过对HBV DNA阳性血清抽样标本进行基因分型,了解佛山地区HBV基因型分布状态.方法以HBV基因组的X区序列为主设计分型引物与探针,将活性氨基标记的探针依次固定在尼龙膜上,制成检测膜条.用标记生物素的引物进行HBV DNA扩增,将扩增产物与检测膜条杂交,以POD与TMB显色,判断基因分型结果,通过与基因测序结果比较确定新方法的有效性.从佛山地区HBV DNA阳性患者血清中随机抽取300份,用新建方法进行HBV基因分型检测.结果新建HBV逆向点杂交基因分型方法可对拷贝数在103～109/ml之间的300份HBV DNA阳性抽检血清进行基因分型,发现B型147例,占49.0%;C型136例,占45.3%;D型1例,占0.3%;B、C混合型12例,占4.0%;C、D混合型4例,占1.3%;未发现A、E和F型.新方法基因分型结果与测序结果一致. 结论利用逆向点杂交技术可以准确有效和简便经济的进行HBV基因分型,适用于临床检测与流行病学研究;在佛山地区,人群中感染的HBV以B、C型为主.
