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结核分枝杆菌持留状态体内外模型的建立与检测
目的 建立体内外结核分枝杆菌持留状态模型,检测在不同条件和化疗阶段中结核分枝杆菌持留菌,探讨其与化学治疗的关系.方法 应用低氧培养、定量逆转录聚合酶链反应测定结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(ICL)、小分子热休克蛋白(Acr)及85B蛋白的mRNA表达变化的方法检测体内外模型中结核分枝杆菌持留菌.结果 体外及动物模型中均存在结核分枝杆菌低氧培养阳性,体外模型中结核分枝杆菌ICL mRNA和Acr蛋白mRNA在低氧条件下表达逐渐增加,4 d时显著增加,其对数值分别为(5.3±0.9)和(6.4±1.6)拷贝/ml,而85B mRNA在有氧条件下明显增加,10 d时的对数值为(6.1±0.9)拷贝/ml,在低氧条件下无明显变化.在小鼠感染与治疗模型中,ICL mRNA在感染的2周和4周均有表达,在治疗4周后下降;Acr mRNA在感染4周及治疗4周不表达或表达很少,治疗8和10周表达量增加,10周的对数值为(6.2±1.7)拷贝/ml,治疗12周直至停药后4周仍有表达,停药4周的对数值为(3.0±1.6)拷贝/ml;而85B蛋白mRNA则在治疗前高表达,对数值为(6.4±1.1)拷贝/ml,随着治疗时间延长而逐渐降低,治疗12周时测定值为阴性.结论 成功建立了结核分枝杆菌持留状态的体外及动物模型,ICL mRNA、Acr蛋白mRNA高表达可作为持留菌存在的哪标志,应用液体低氧培养并联合mRNA检测有可能检测到结核分枝杆菌持留菌.
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10-23脱氧核酶对结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶表达的影响及其抗菌作用
目的 探讨10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRZ)抑制结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase,ICL)的表达及其在抗结核分枝杆菌感染中的作用.方法 根据计算机模拟的结核分枝杆菌ICL mRNA的二级结构设计合成5条ICL特异的10-23 DRZ(DZ1～DZ5),在无细胞反应体系中鉴定其对结核分枝杆菌ICL mRNA的切割活性后,在不同条件下用DZ4对结核分枝杆菌进行处理,于处理后不同时间检测ICL酶活性变化,间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测ICL的表达.用异烟肼单独处理及DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌感染人巨噬细胞系THP-1细胞,于感染后不同时间用Ziehl-Heelson染色法和结核分枝杆菌培养计数的方法,观察10-23DRZ对结核分枝杆菌感染巨(口筮)细胞的影响,同时取经异烟肼单独处理及DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌接种于Middle Brook 7H10(M7H10)培养基,观察10-23DRZ对在巨噬细胞外生长的结核分枝杆菌的影响.结果 DZ1、DZ3、DZ4和DZ5在无细胞反应体系中可对ICL mRNA进行有效切割,且其活性具有高度特异性.5 μmol/L DZ4与异烟肼联合应用时可显著抑制结核分枝杆菌ICL的表达,与单用相应浓度的异烟肼比较,处理1、2、3周后结核分枝杆菌ICL酶活性分别下降34.9%、46.6%、46.7%(异烟肼10μg/L)或21.9%、33.48、36.9%(异烟肼5μg/L).DZ4与异烟肼联合处理后的结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活的能力显著下降,在感染后4 d和7 d时,THP-1细胞内的荷菌量分别由单用相应浓度异烟肼处理对照组的126.5×104 CFU、307.5×104 CFU(异烟肼10μg/L)和133.0×104CFU、325.4×104CFU(异烟肼5μg/L)下降至54.6×104CFU、114.3×104CFU和71.7×104CFU、174.4×104 CFU.10-23DRZ对结核分枝杆菌在M7H10培养基中生长无明显影响.结论 异烟肼可有效促进10-23DRZ进入结核分枝杆菌;10-23DRZ与亚抑菌浓度的异烟肼联用可有效抑制结核分枝杆菌ICL的表达,降低其在巨噬细胞中的存活能力.
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分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定
目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1(+), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.
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结核分枝杆菌的aceA基因的克隆、序列测定及生物信息学分析
目的克隆编码结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶的基因aceA (1915,1916),对其全序列进行测定,并以生物信息学方法和软件分析其生物学特性,为进一步研究该酶的功能提供信息资料.方法用PCR系统扩增出异柠檬酸裂合酶基因片段,将其插入载体pET28a,对其全序列进行测定;利用序列对比分析、蛋白氨基酸序列分析及结构预测软件进行生物信息学分析和模拟.结果克隆的基因序列与报道的序列完全一致,aceA与icl及其他编码异柠檬酸裂合酶基因同源性很高,具有保守氨基酸共有序列;初步模拟出了该蛋白的三级结构.结论本研究通过对aceA基因序列和氨基酸进行生物信息学分析,获取了该酶的信息特征,并与现有的报道结果进行对比分析,为分子生物学诊断、治疗和药靶筛选提供理论依据.
