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小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ1高表达对游离脂肪酸介导的β细胞损害的保护作用
目的观察小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(PPARγ1)基因高表达对游离脂肪酸(FFA)介导的胰岛βTC3细胞损伤的影响. 方法克隆构建重组载体pcDNA3.1/PPARγ1,并在βTC3细胞中进行稳定表达,用半定量RT-PCR对其表达进行鉴定.之后,采用四唑盐(MTT)比色试验比较细胞暴露于较高水平FFA 48 h后的细胞活力. 结果克隆出中国昆明小鼠PPARγ1全长基因,其cDNA序列与Genbank的PPARγ1基因序列基本相同,仅编码第421位天冬酰胺的密码子由AAU变成了AAC.经鉴定PPARγ1基因有效地在βTC3细胞中获得了表达.野生型βTC3细胞暴露于较高水平FFA 48 h后细胞活力下降(P<0.01),且FFA浓度越高细胞活力下降越明显(r=-0.962,P<0.01);而PPARγ1高表达βTC3细胞的细胞活力无明显改变(P>0.05). 结论 PPARγ1高表达可保护胰岛βTC3细胞免于FFA介导的损伤.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ1 基因表达 胰岛移植 脂肪酸类 非酯化 -
携带人PPARγ1受体基因高效真核表达载体的构建及其意义
目的:构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(hPPARγ1)的真核表达载体,为hPPARγ1受体功能和基于hPPARγ1受体靶点的药物筛选提供分子研究平台.方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARγ1全长基因,与经XhoⅠ、SmaⅠ相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP,经酶切及测序鉴定重组质粒中hPPARγ1基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARγ1的表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测.结果:经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARγ1的高效表达.结论:成功构建phPPARγ1-IRES2-EGFP重组质粒,为基于hPPARγ1受体靶点的药物筛选平台的建立及受体功能研究提供了高效表达载体.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ1 基因克隆 真核表达 -
瘦素抑制小鼠PPARγ1基因表达的机制探讨
目的 探讨瘦素抑制小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) γ1基因表达的可能机制.方法 从UCSC数据库获得小鼠PPARγ1基因转录起始点上游约3 kbp的序列,分别运用Patch和Signal Scan在线软件分析该序列,筛选出两组结果中相同的转录因子及相应的结合位点,并找出其中与脂质代谢和脂肪细胞分化相关的转录因子,采用Western blot和瞬时转染实验验证.结果 经过筛选,GATA结合蛋白2(GATA-2)是与脂质代谢和脂肪细胞分化相关的转录因子.Western blot结果显示,经瘦素处理的肝星状细胞的GATA-2表达升高(P＜0.05);在转染pPPARγ1(-2333)Luc的肝星状细胞中,瘦素处理后的荧光素酶活性降低(P＜0.05),而在转染pPPARγ1(-1823)Luc、pPPARγ1(-1313)Luc的肝星状细胞中,瘦素处理后的荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05).与转染pPPARγ1(-2333)Luc的肝星状细胞相比,转染pPPARγ1 (GATA mut)Luc的肝星状细胞荧光素酶活性升高(P＜0.05).结论 GATA-2通过与PPARγ1的5'端转录起始点上游-1823～-2333的区域结合参与瘦素对小鼠PPARγ1基因表达的抑制.
关键词： 瘦素 过氧化物酶体增殖物激活受体γ1 转录因子 肝星状细胞 生物信息学 -
过表达PPARγ1基因对大鼠心肌缺血再灌注后心梗面积和炎症反应的影响
目的 研究过表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(PPARγ1)基因对心肌缺血-再灌注后梗死面积、形态学、选择素E和选择素P mRNA表达的影响.方法 30只SD大鼠随机分为3组(n=10),包括假手术组(Sham组)、心肌缺血-再灌注损伤组(MIRI组)、过表达PPAR γ1组(PPARγ 1组).Sham组和MIRI组经冠脉转染携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-EGFP)至心肌组织,PPAR γ1组转染携带PPAR γ1基因的腺病毒载体(Ad-PPARγ1).待目的基因转染3d后,Sham组仅开胸,不阻断左前降支,MIRI组和PPAR γ1组建立心肌缺血-再灌注损伤模型,结扎冠脉左前降支30 min,开放120 min后,检测梗死面积、形态学、选择素E和选择素P mRNA的表达情况.结果 再灌注末,MIRI组和PPAR γ1组心梗死面积、选择素E和选择素P mRNA的表达明显上调,PPARγ 1组低于MIRI组(P＜0.05),MIRI组和PPARγ 1组缺血面积百分比无明显差异(P＞0.05).光镜下观察MIRI组和PPARγ1组炎症反应强于Sham组,MIRI组强于PPAR γ1组.结论 大鼠心肌过表达PPARγ1基因能够改善心肌缺血-再灌注损伤,减少心梗面积,抑制炎症反应,其机制可能与抑制选择素E和选择素P mRNA的表达上调有关.
关键词： 心肌缺血-再灌注损伤 过氧化物酶体增殖物激活受体γ1 心梗 炎症反应 选择素 -
PPARγ1基因转染对缺血再灌注心肌细胞凋亡的作用和影响
目的 探讨心肌细胞过表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(PPARγ1)基因对缺血再灌注损伤导致细胞凋亡的作用和影响.方法 30只SD大鼠随机分为SHAM组、MIRI组、PPARγ1组,每组10只.SHAM组和MIRI组经冠状动脉转染携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-EGFP),PPARγ1组转染携带PPARγ1基因的腺病毒载体(Ad-PPARγ1)至心肌组织.稳定3 d后,SHAM组只过线,不接扎;MIRI组和PPARγ1组行心肌缺血再灌注损伤(缺血30 min,再灌注120 min).电镜下观察各组心肌的超微结构变化,Western blot检测B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl2)和Bcl2相关X蛋白(Bax),DNA断裂的原位末端标记法观察心肌细胞凋亡情况.结果 缺血再灌注后,电镜下MIRI组心肌细胞结构损伤严重,心肌纤维排列紊乱,有断裂和溶解现象,线粒体肿胀,结构模糊,部分嵴断裂溶解;PPARγ1组结构损伤较MIRI组减轻.与SHAM组比较,MIRI组Bcl2/Bax比值下降(P<0.05),PPARγ1组无明显变化(P>0.05);与MIRI组比较,PPARγ1组Bcl2/Bax比值上升(P<0.05).MIRI组和PPARγ1组的心肌细胞凋亡数目较SHAM组升高(P<0.05);MIRI组高于PPARγ1组(P<0.05).结论 过表达PPARγ1基因能通过抗氧化应激、减少细胞凋亡来保护缺血再灌注心肌.
关键词： 心肌缺血再灌注损伤 过氧化物酶体增殖物激活受体γ1 细胞凋亡 -
PPARγ1基因转染对心肌缺血再灌注后的影响和意义
目的 探讨心肌细胞过表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(PPARγ1)基因后对缺血再灌注损伤导致的血流动力学、心肌梗死(心梗)面积、血清肌钙蛋白I(cTnI)及心肌基质金属蛋白酶-9(MMP-9)浓度的变化及意义.方法 30只SD大鼠随机分成3组(n=10):SHAM组、MIRI组及PPARγ1组.SHAM组和MIRI组开胸经冠状动脉(冠脉)转染携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-EGFP),PPARγ1组转染携带PPARγ1基因的腺病毒载体(Ad-PPARγ1)至心肌组织.稳定3 d后重新开胸,SHAM组只过线,不接扎;MIRI组及PPARγ1组结扎冠脉左前降支30 min,再灌注120 min.观察缺血前(T0)、缺血30 min(T1)、再灌注30 min(T2)、再灌注120 min(T3)时的心率(HR)、平均动脉压(MAP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP),左室压大上升和下降速率(±dp/dt max);再灌注120min时检测心梗面积、血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)和组织MMP-9浓度的变化.结果 与T0时比较,T1~T3时MIRI组、PPARγ1组LVEDP升高,HR减慢,LVSP和(±dp/dt max)降低,MAP除PPARγ1组在T3时差异无统计学意义,也明显降低(P<0.05);与SHAM组比较,T1~T3时MIRI组、PPARγ1组LVEDP升高,HR减慢,LVSP和(±dp/dt max)降低,MAP除PPARγ1组在T3时差异无统计学意义,也明显降低(P<0.05);与MIRI组比较,PPARγ1组±dp/dt max升高,LVSP在T2、T3时升高,MAP在T3时升高(P<0.05);SHAM组无心肌梗死,MIRI组和PPARγ1组的缺血面积差异无统计学意义(P>0.05),而MIRI组和PPARγ1组心肌梗死面积、cTnI和MMP-9均高于SHAM组,PPARγ1组低于MIRI组(P<0.05).结论 过表达PPARγ1基因能通过减轻缺血再灌注过程中血流动力学紊乱、减少心梗面积、降低血清cTnI及组织MMP-9的浓度,从而起到保护心肌的作用.
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重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系的建立
目的:建立含人PPARγ1受体基因phPPARγ1-IRES2-EGFP重组质粒高效体外转染表达体系.方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将phPPARγ1-IRES2-EGFP转染入293细胞,荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达强度及其转染效率,并对转染细胞hPPARγ1表达进行荧光定量PCR和Western Blot分析.结果:荧光显微镜下可见转染phPPARγ1-IRES2-EGFP质粒的293细胞GFP报告基因高表达,转染效率为(83±11)%;荧光定量PCR和Western Blot检测结果表明,转染细胞hPPARγ1表达水平高于空载体对照组3个数量级,说明导入的重组质粒能够高效表达hPPARγ1.结论:成功建立phPPARγ1-IRES2-EGFP重组质粒高效体外转染表达体系,为hPPARγ1受体功能研究和基于hPPARγ1为靶标的药物筛选平台建立打下了良好的基础.
关键词： 过氧化物酶体增殖物激活受体γ1 转染效率 真核表达 293细胞
