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人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达的研究
人胰岛素基因(PCMV.INS)经壳聚糖中介,成功地转染到NIH3T3细胞并证明表达有效.这有助于1型糖尿病基因治疗的研究.
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肝型丙酮酸激酶启动子与人胰岛素基因逆转录病毒介导感染pT67、HepG2细胞的蛋白质表达
目的 检测新构建肝型丙酮酸激酶启动子(LPKp)与人胰岛素基因(hInsg)逆转录病毒表达载体(pM54,LPKp-hlnsg)在pT67、HepG2细胞的表达情况,为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病寻找新的优化生物载体. 方法 (1)限制酶切父、母本质粒p54、pMDN-SIN,取相关片段构建含人Ins基因-逆转录病毒载体pM54(pMDN-SIN+p54;LPKwhlnsg);pM54扩增、纯化、酶切鉴定;(2)脂质体FuGENE 6转染pM54质粒进入pT67、Phoenix E和3T3细胞系,同时转染pCMVβGal和父本质粒p54做对照;(3)制备转染后细胞培养拟逆转录病毒上清液;(4)用转染后细胞培养上清液旋转感染pT67、HepG2细胞;(5)ELISA法检测转染、感染后细胞培养上清液Ins含量. 结果 酶切鉴定质粒与构建预期相符;ELISA法检测出转染、感染上清液中均含较高水平Ins.对照结果均为阴性. 结论 LPKp-hInsg基因逆转录病毒表达载体pM54构建成功.人胰岛素基因逆转录病毒介导旋转感染pT67等细胞,目的 蛋白Ins获得了预期的表达.实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究奠定了基础.
关键词： 人胰岛素基因 胰岛素 肝型丙酮酸激酶启动子 逆转录病毒载体 基因表达 -
人胰岛素基因在幼仓鼠肾细胞中的表达及降血糖实验研究
目的: 构建并筛选人胰岛素基因真核高效表达载体.方法:常规法构建重组质粒pEF1α-ImINS.将重组质粒pEF1α-ImINS和胰岛素其他3个重组质粒分别转染幼仓鼠肾(BHK)细胞,经G418筛选,阳性克隆传至20代,分别用放射免疫和免疫组化技术分析胰岛素和(或)胰岛素原在BHK细胞中表达的情况.并用重组质粒pEF1α-ImINS转染BHK细胞的阳性克隆20代的PBS细胞悬浮液(5×107个/只)及其培养上清(0.5 ml/只)对昆明小鼠行腹腔注射,通过对注射前后小鼠血糖值测定,分析转基因产物降血糖的生物学效应.结果:胰岛素的表达量高为7.984 μIU/ml ,胰岛素表达水平的灰度值在BHK细胞质中为177.5±15.10,细胞核中为150.3±21.43;昆明小鼠注射pEF1α-ImINS转染BHK克隆细胞株的悬浮液后6 h与注射前24 h血糖值比较,差异极显著(P<0.01).结论:BHK细胞中重组质粒pEF1α-ImINS是胰岛素表达量高的质粒;pEF1α-ImINS转染的克隆细胞株在小鼠体内有胰岛素表达,并且对正常小鼠有降血糖的作用.
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人胰岛素基因重组杆状病毒在家蝇中表达的研究
目的:利用杆状病毒表达系统进行人胰岛素基因在家蝇中表达的研究.方法:用携带有人胰岛素基因的重组杆状病毒感染家蝇幼虫,用放射免疫技术、Tricine-SDS-PAGE和Western-blot技术对蝇蛆胰岛素表达水平进行检测.结果:重组的杆状病毒感染家蝇幼虫后,蝇蛆中有人胰岛素的表达,表达量为37.401μIU/ml,占蝇蛆总蛋白的0.583%.结论:利用杆状病毒表达系统可以在家蝇蝇蛆中表达人胰岛素.
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植物细胞表达人胰岛素的载体构建
目的构建人胰岛素的植物细胞表达载体.方法设计多对引物,通过PCR反应合成霍乱毒素B亚单位(CTB)基因和不带C肽的人胰岛素基因.将霍乱毒素B亚单位(CTB)基因与这种不带C肽的人胰岛素基因融合后,插入克隆载体,然后用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ进行酶切,并将酶切的融合基因片段连接在植物表达载体pBI121上,后用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ进行酶切鉴定.结果测序结果表明,PCR扩增的目的基因顺序与设计完全一致,并构建了克隆载体和植物表达载体.植物表达载体经酶切后鉴定,所含基因片段大小与预期相符.结论已成功地构建了人胰岛素基因的植物细胞表达载体.
关键词： 人胰岛素基因 霍乱毒素B亚单位(CTB) 植物表达载体 -
携带可调控人胰岛素基因的腺病毒载体的构建和鉴定
目的:构建携带葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)启动子控制下的人胰岛素基因的腺病毒载体.方法:将GIP-hIns基因自pCDNA3-GIP-hIns质粒中酶切下来,克隆至切除CMV启动子的pCA13-△CMV质粒中,形成转移质粒pCA13-GIP-hIns,然后与质粒pBHGE3共转染至293细胞株,在其中同源重组形成腺病毒颗粒.采用PCR方法对重组体进行鉴定,同时测定病毒滴度.体外转染STC-1细胞,并采用RT-PCR检测感染腺病毒的细胞内有无hIns mRNA的转录.结果:由pCA13-GIP-hIns和pBHGE3共转染至293细胞后,可得到阳性重组体Ad.GIP-hIns,经PCR检测表明已含有GIP-hIns基因.纯化所得腺病毒滴度约为1×1011pfu/ml.RT-PCR证实在感染重组体腺病毒Ad.GIP-hIns的细胞中有相应mRNA的转录.结论:成功构建了携带GIP启动子控制下的人胰岛素基因的腺病毒载体,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础.
关键词： 腺病毒载体 葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP) 人胰岛素基因 -
重组人胰岛素基因真核表达质粒的多聚酶链反应
目的:鉴定重组人胰岛素基因真核表达质粒.方法:应用多聚酶链反应鉴定重组人胰岛素基因真核表达质粒pCMV.Ins.结果:显示insulin基因已经插入重组基因中,人胰岛素基因真核表达质粒已成功构建.结论:已成功构建真核表达载体pCMV.Ins, 为进一步进行胰岛素基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞,使之产生胰岛素的研究奠定了坚实的基础.
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人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内的表达
目的研究人胰岛素基因表达质粒在体外转染鼠成纤维细胞(NIH3T3)后对糖尿病大鼠血糖的影响.方法采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞(NIH3T3),转染后72 h,经G418抗性筛选出阳性克隆并培养到第24 d,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达,同时用ELASA法监测转染后24 d的细胞培养液的胰岛素水平.并将阳性克隆大量扩增,注射至糖尿病大鼠腹腔内,并与转染空载体的对照细胞比较,观察在糖尿病大鼠体内的胰岛素表达及对血糖等变化的影响.结果转染PCMV.INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组(P＜0.01)及PCMV转染组(P＜0.01),未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化(P＞0.05).接受胰岛素表达载体细胞的糖尿病大鼠,血糖明显下降,体重逐渐恢复.结论人胰岛素基因能成功转染非胰岛β细胞,并表达目的基因使血糖水平下降说明基因治疗有望成为1型糖尿病的重要治疗手段,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体.
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壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外表达的研究
目的研究壳聚糖介导人胰岛素基因在糖尿病鼠体内外转染及表达.方法采用壳聚糖体外转染鼠成纤维细胞,对转染后72h的细胞应用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达.27只糖尿病大鼠随机分为3组(pCMV.INS组、pCMV组、生理盐水组),体内转染通过尾静脉注射糖尿病大鼠,检测空腹血糖和胰岛素.结果pCMV转染细胞无胰岛素表达,pCMV.INS转染大约10%的细胞有胰岛素表达;pCMV.INS转染大鼠血浆胰岛素显著高于生理盐水对照组(P<0.01)和pCMV对照组(P<0.01).结论人胰岛素基因可通过壳聚糖直接转染至糖尿病大鼠体内发挥治疗作用及壳聚糖可能是一种很有前途的基因载体.
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人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达
目的研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达.方法采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞(NIH3T3),转染后72h,经G418抗性筛选出阳性克隆并培养到第24d,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达,同时用ELASA法监测转染后24d的细胞培养液的胰岛素水平.结果转染PCMV.INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组(P<0.01)及PCMV转染组 (P<0.01),未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化(P>0.05).结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为1型糖尿病的重要治疗手段,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体.
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转染携带人胰岛素基因慢病毒载体提高颗粒脂肪移植物存活率的实验研究
目的 探讨转染携带人胰岛素基因慢病毒载体提高颗粒脂肪移植物存活率的可行性.方法 将携带人胰岛素基因慢病毒载体转染后的人脐带人间充质干细胞(hUCMSCs)与人颗粒脂肪复合分为3组:A组[移植颗粒脂肪1mL+0.4mL达尔伯克(氏)必需基本培养基(DMEM)],B组[颗粒脂肪1 mL+0.4 mL DMEM+2×105 hUCMSCs(CM-Dil标记)],C组[颗粒脂肪1 mL+0.4 mL DMEM+2×105hUCMSCs(CM-Dil标记+转染)].使用2 mL注射器接16号针头注射到Wistar大鼠背部皮下.3月后,每组取6只沿被膜分离移植物,取样行湿重测定,HE、马松三色染色,荧光观察.结果 C组湿重、血管数均高于A、B组(P＜0.05),存活率(移植后脂肪湿重/移植前脂肪湿重)高于A、B组(P＜0.05).结论 将携带重组人胰岛素慢病毒载体转染后的hUCMSCs与脂肪颗粒复合移植能提高颗粒脂肪移植成活率.
