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E1A激活基因阻遏子基因表达与血管外膜成纤维细胞表型转化的关系
目的：探讨E1A激活基因阻遏子（CREG）基因表达与血管外膜成纤维细胞（AFs）表型转化间的关系。方法制作小鼠颈动脉损伤模型，免疫荧光染色观察血管外膜中CREG与平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达变化；培养小鼠原代AFs，外源性应用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导其表型转化，RT-PCR和Western-blot检测不同作用时间及不同浓度AngⅡ刺激AFs后CREG和α-SMA mRNA和蛋白质表达。结果血管损伤后1 d、3 d血管外膜增生显著，外膜中α-SMA表达显著上调，而CREG表达显著下调；血管损伤后7 d、14 d外膜增生有所缓解，α-SMA表达水平逐渐下降，而CREG表达也有所恢复。应用AngⅡ诱导AFs发生表型转化，AFs中α-SMA mRNA和蛋白水平显著上调，而CREG mRNA和蛋白水平显著下调，并且呈时间和剂量依赖性。结论在体和离体模型均表明AFs表型转化过程中伴随CREG基因表达下调，提示CREG基因可能参与AFs的表型转化。
关键词： E1A激活基因阻遏子 血管外膜成纤维细胞 表型转化 -
CREG1蛋白对血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心功能损伤的影响
目的 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG1)蛋白能否改善心肌纤维化小鼠的心功能.方法 应用基因打靶方法建立广泛性基因敲除的CREG1杂合子小鼠和CREG1野生型小鼠模型.应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)皮下埋泵方法建立小鼠心肌纤维化损伤模型,给予AngⅡ刺激14d后,采用HE和Masson染色检测小鼠心肌纤维化情况.应用Westernblotting和免疫组化染色技术检测给予AngⅡ前及3、7、14d后两组小鼠心肌中CREG1蛋白的表达,并于给予AngⅡ14d后应用小动物超声仪检测心功能情况.AngⅡ给药同时,以皮下埋泵方式分别给予15、30、60、300μg/(kg.d)的外源性重组CREG1蛋白(治疗组)和生理盐水(对照组)14d,检测心功能,并应用TUNEL染色和Western blotting检测心肌凋亡情况.结果 Western blotting和免疫组化检测结果显示,未给予AngⅡ刺激时杂合子小鼠心肌中CREG1蛋白表达明显低于野生型小鼠(P＜0.05).给予AngⅡ刺激3、7、14d时,野生型小鼠和杂合子小鼠心肌中CREG1蛋白表达均明显下降(P＜0.05),但杂合子小鼠下降更为显著(P＜0.01);HE和Masson染色显示杂合子小鼠心肌纤维化程度较野生型小鼠严重,二者心功能明显下降,且杂合子小鼠心功能下降更为明显(P＜0.05).给予外源性重组CREG1蛋白治疗后,治疗组心功能较对照组明显改善(P＜0.05),心肌凋亡数量明显下降(P＜0.05).结论 在AngⅡ引起的小鼠心肌纤维化模型中,CREG1蛋白减少可使小鼠心功能损伤加重,给予外源性重组CREG1蛋白可明显改善心功能.
关键词： E1A激活基因阻遏子 心肌纤维化 心功能 -
E1A激活基因阻遏子蛋白过表达可抑制人血管平滑肌细胞的迁移
背景:成熟动脉中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)分化稳态的丧失是血管老化的一个重要原因.目的:观察E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)抑制人血管平滑肌细胞迁移的分子机制.方法:应用已建立的稳定转染CREG过表达细胞hVSMCs-CREG和CREG表达沉默的hVSMCs-siCREG细胞株通过刮伤实验和Transwell小室细胞移行实验检测细胞迁移能力,通过Western blot检测转染前后细胞中CREG蛋白、基质金属蛋白酶和JNK表达及活化情况,应用JNK和基质金属蛋白酶9抑制剂阻断研究分析上述信号分子表达变化在细胞迁移中的作用.结果与结论:Western blot结果证实,CREG蛋白表达在hVSMCs-CREG组中增加(P < 0.05),而在hVSMCs-siCREG组中减少(P < 0.05).刮伤实验和Transwell实验分析结果证实hVSMCs-CREG组细胞较正常对照组细胞迁移能力受抑.相反,hVSMCs-siCREG组细胞迁移能力显著增加(P < 0.05).Western blot和明胶酶谱分析证实hVSMCs-siCREG组细胞中MMP9活性明显增加(P < 0.05),同时JNK蛋白活化.进一步应用JNK抑制剂阻断研究证实,CREG蛋白表达抑制引起的血管平滑肌细胞迁移能力增加与细胞中基质金属蛋白酶9活性均受到剂量依赖性抑制.结果证实,CREG蛋白表达可抑制JNK-基质金属蛋白酶9信号通路的活化,以此抑制体外培养的人血管平滑肌细胞迁移.
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重组人CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用
背景：以往研究证实，CREG是一种与M6P/IGFⅡR直接结合的溶酶体蛋白，并依赖于与M6P受体的相互作用有效转运至溶酶体。
目的：分析外源性CREG蛋白与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR的相互作用关系及其对M6P/IGFⅡR表达变化及细胞内定位的影响。
方法：应用细胞免疫荧光双染和免疫共沉淀方法，观察外源性 CREG 蛋白与溶酶体组织蛋白酶和 M6P/IGFⅡR的相互作用关系，并应用gain-of-function和loss-of-function模型，通过Western blot和细胞免疫荧光双染方法，观察CREG对M6P/IGFⅡR表达变化及细胞内定位的影响。
结果与结论：细胞免疫荧光双染和免疫共沉淀方法证实外源性 CREG 蛋白与溶酶体组织蛋白酶和 M6P/IGFⅡR有直接相互作用关系；应用gain-of-function和loss-of-function模型进一步证实，CREG对M6P/IGFⅡR表达变化无影响，而影响其在细胞内的定位。提示外源性CREG蛋白定位于溶酶体，且与溶酶体组织蛋白酶和M6P/IGFⅡR有相互作用关系，并影响M6P/IGFⅡR的细胞内定位。 -
E1A激活基因阻遏子(CREG)对过氧化氢诱导骨髓间充质干细胞凋亡保护作用的实验研究
目的 探讨EIA激活基因阻遏子(CREG)过表达修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)能否有效对抗炎症因子过氧化氢(H2O2)诱导的BMSCs细胞凋亡,为其在视网膜变性类疾病的治疗提供理论基础.方法 实验研究.对2012年1月至2014年12月在内蒙古民族大学附属医院眼科实验研究,以原代培养的大鼠BMSCs为实验细胞模型,以携带有CREG基因的腺病毒载体感染BMSCs,制备CREG基因修饰的BMSCs,Western blot及荧光显微镜鉴定CREG基因在BMSCs中的表达效率.TUNEL法检测添加500 μmol/L过氧化氢(H2O2)刺激24 h后,检测controlBMSCs组、normBMSCs组、GF-PBMSCs组、CREGBMSCs组的BMSCs凋亡率.Western blot方法检测caspase-3及BCL-2表达量.结果 (1)瞬时转染Ad-GFP的BMSCs中GFP(绿色荧光蛋白)表达量达到90％,所构建的载体成功将目的基因CREG转染BMSCs.(2)通过TUNEL法和Western blot检测研究发现,Ad-CREG瞬时转染的BM-SCs可以有效抑制500 μmol/L H2O2刺激24 h后诱导的凋亡,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 体外诱导BMSCs过表达CREG能有效抑制炎性因子H2O2诱导的BMSCs凋亡,对提高移植后BMSC存活率及今后应用于治疗视网膜变性类疾病可能发挥一定作用.
关键词： 骨髓间充质干细胞 E1A激活基因阻遏子 过氧化氢H2O2 细胞凋亡 -
CREG促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及溶酶体组织蛋白酶表达
目的:研究E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor ofEl A-stimulated genes,CREG)对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及溶酶体组织蛋白酶表达的影响.方法:应用loss-of-function和gain-of-function模型,Lysotracker Red染色和透射电镜观察CREG对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生的影响,并通过细胞免疫荧光染色和Western blot方法,观察CREG对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体组织蛋白酶表达的影响.结果:Lysotracker Red染色和透射电镜证实CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生;细胞免疫荧光染色和Western blot方法证实CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体组织蛋白酶cathepsinB及cathepsin S表达.结论:CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及组织蛋白酶cathepsinB及cathepsinS表达.
关键词： E1A激活基因阻遏子 巨噬细胞 溶酶体 -
E1A激活基因阻遏子对抗肿瘤坏死因子α引起的血管内皮细胞炎性损伤
目的 探讨E1A激活基因阻遏子表达对血管内皮细胞病理性炎症反应的生物学作用及机制.方法 以E1A激活基因阻遏子过表达和基因沉默的人动脉血管内皮细胞为细胞模型,应用肿瘤坏死因子α刺激,ELISA检测白细胞介素6的变化,Rhodamin-Phalloidin检测肌动蛋白骨架F-actin分布,应用Transwell小室和Biotin标记的BSA检测单层内皮细胞通透性改变.进一步通过免疫荧光染色和Western blot检测细胞内核因子κB蛋白表达和转位情况.结果 ELISA检测发现,E1A激活基因阻遏子基因过表达显著抑制肿瘤坏死因子α刺激引起血管内皮细胞白细胞介素6的表达及分泌增加.同时,细胞F-actin应力纤维的形成和细胞单层通透性增加受到明显抑制.相反,E1A激活基因阻遏子基因沉默组白细胞介素6分泌较对照组明显增多.细胞F-actin应力纤维形成、细胞单层通透性显著增加.免疫荧光和Westem blot分析证实,肿瘤坏死因子α刺激后,E1A激活基因阻遏子过表达组核因子κB出现短时的入核现象并迅速出核,对应蛋白出现相应的表达变化,而E1A激活基因阻遏子基因沉默组核因子κB表达持续增高且发生明显的入核转位现象.结论 E1A激活基因阻遏子可通过减少核因子κB的表达对抗肿瘤坏死因子α刺激引起的血管内皮细胞炎症反应和细胞通透性增加,对抗细胞病理性损伤发生.
关键词： E1A激活基因阻遏子 血管内皮细胞 炎性损伤 核因子κB -
E1A激活基因阻遏子在动脉粥样硬化血管中的表达及其与炎症因子的关系
目的 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)在动脉粥样硬化(AS)血管中的表达及其与炎症因子的关系.方法 ApoE(-/-)小鼠6周龄断奶后给予高脂喂养.8周后取主动脉血管,采用HE染色观察血管的形态学变化;采用免疫荧光染色观察CREG、SMα-actin和巨噬细胞标志物Mac-3的表达变化.取高脂喂养的1～8周小鼠血管,采用Western blot方法检测AS血管中CREG及核转录因子(NF)-κB的表达的变化.结果 在ApoE(-/-)小鼠高脂喂养8周,主动脉血管AS斑块明显形成,斑块内有胆固醇结晶,斑块凸凹不平,管腔明显狭窄.免疫荧光显示AS血管中,CREG表达明显下降,同时SMα-actin表达也下降,而Mac-3表达增高.ApoE(-/-)小鼠高脂喂养2～8周,取动脉血管行蛋白定量分析,结果显示高脂喂养2周时,CREG在动脉血管中的表达不是降低,而是明显升高,高脂喂养第4周,CREG表达急剧下降,而后又逐渐上升,但不能升至正常水平.同时NF-κB随着时间的推移,表达逐渐升高.结论 在AS进程中,血管中膜的VSMCs由收缩表型向合成表型转化,细胞增生活跃、分化减弱,CREG作为维持VSMCs分化的蛋白,在血管中的表达与AS进展密切相关,同时伴随着炎症因子表达逐渐升高.
