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串联质谱检测干血滤纸片多种溶酶体酶活性方法的建立
目的：建立串联质谱法测定干血滤纸片中半乳糖神经酰胺酶（ GALC）、酸性α-葡萄糖苷酶（ GAA）、α-半乳糖苷酶（ GLA）、α-L-艾杜糖苷酸酶（ IDUA）活性。方法方法学建立。收集2013年7月、11月在上海市新华医院新生儿筛查中心进行遗传代谢性疾病筛查的2175份干血滤纸片标本和2012年9月至2014年1月在新华医院儿科就诊的20例溶酶体贮积病（ lysosomal storage disorders，LSDs）患儿干血滤纸片样本。干血滤纸片提取液与酶底物及内标孵育后，经液液和固相萃取，氮气吹干，复溶后串联质谱分析酶反应产物和内标，计算酶活性。评价方法的线性、精密度、准确度和低检测限；检测2175份新生儿-干血滤纸片样本，0.5～99.5百分位数法确立4种酶活性参考区间；同时检测20例LSDs患儿干血滤纸片样本进行临床验证。结果酶活性测定批内和批间精密度为1.7％～11.8％，批内和批间准确度为85％～115％，产物和内标实测浓度比值与添加的理论浓度比值线性系数为0.997～0.999。 GALC、GAA、GLA和IDUA的低检测限分别为0.03μmol／（ L· h）、0.09μmol／（L· h），0.12μmol／（L· h），0.16μmol／（L· h）；初步确定新生儿酶活性参考区间分别为GALC[0.51～8.51μmol／（L· h）]，GAA[1.99～22.22μmol／（L· h）]，GLA[1.68～41.59μmol／（L· h）]，IDUA [2.36～19.21μmol／（L· h）]；20例LSDs患儿酶活性明显低于参考区间，串联质谱法能有效检出Krabbe、Pompe、Fabry、MPSⅠ患儿。结论成功建立了串联质谱法检测干血滤纸片中GALC、GAA、GLA、IDUA活性。（中华检验医学杂志，2016，39：761-765）
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伴脑血管病的晚发型Pompe病一家系临床、病理和分子遗传学特点
目的 报道1个以脑血管病为主要临床表现的晚发型Pompe病家系,总结其临床、病理和分子遗传学特点.方法 对1个伴脑血管病的兄妹共患病晚发型Pompe病家系进行家系调查和临床、病理资料收集；5名家系成员均行酸性α-糖苷酶(GAA)基因目的片段PCR扩增与测序.结果 患病者为兄妹2人,均有自青少年期出现的进行性肢带肌无力,近来出现眩晕、共济失调等症状方就诊,颅脑CT和MRI示梗死、出血和脑白质多发缺血变性灶,其中哥哥颅脑CT血管成像(CTA)示脑动脉多处狭窄与后循环系统多发动脉瘤,妹妹颅脑CTA仅显示有多处动脉串珠样狭窄.前者肌肉活体组织检查病理表现为典型的空泡样变性和肌纤维内糖原的沉积.2例患者GAA酶活性均明显低于正常.对该家系5位家族成员(包括2例患者)的GAA基因分析发现2例患者及其母亲存在第9号外显子自1388位点起19个碱基的杂合缺失突变.结论 以后循环受累为主的脑血管病是Pompe病少见的特殊表型.GAA基因c.1388 del 19为新发突变,与临床表型的关系尚不能确定.
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作用于不同靶点的抗乙型肝炎病毒天然药物的研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)是导致乙型肝炎的严重致病因子之一,属于DNA病毒,具有较强的复制增殖能力和典型的病毒感染过程.具有抗HBV作用的天然药物作用机制往往与核苷类药物不同,抑制HBV增殖的作用靶点主要集中在HBV转录过程中的启动子及其与HBV启动子结合的肝细胞核因子、HBV成熟组装过程中的热激同源蛋白70和α葡糖苷酶以及DNA损伤修复过程中的重要激酶ATM等.本文介绍了HBV的生物学特征和HBV感染过程,并且以天然药物抑制HBV增殖的不同靶点为阐述依据,介绍相关天然药物的研究进展.
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对《糖原贮积病Ⅱ型诊断及治疗专家共识》的解读
糖原贮积病Ⅱ型是一种罕见的进展性溶酶体贮积病,由位于第17号染色体上的酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因突变所致,呈常染色体隐性遗传.明确诊断依靠肌肉组织活检、血清α-葡糖苷酶活性检测和GAA基因突变分析.2006年以来,人重组α-葡糖苷酶用于该病的治疗,使患者预后显著改善.201 3年《糖原贮积病Ⅱ型诊断及治疗专家共识》在《中华医学杂志》发表,有助于提高国内相关专科医师对该病的认识以及诊断与治疗水平.
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Myozyme对一例依赖呼吸机辅助通气的晚发型糖原贮积病Ⅱ型患者疗效研究
目的 观察Myozyme对依赖呼吸机辅助通气的晚期晚发型糖原贮积病Ⅱ型患者的治疗效果.方法 参照药品说明书要求,对1例晚发型糖原贮积病Ⅱ型患者进行Myozyme治疗,剂量20 mg/kg(1次/2 ～4周),连续治疗6次,末次给药距首次给药间隔4个月;首次给药前须经静脉注射地塞米松5 mg预处理.随访16个月,记录每日运动功能、脱机时间和呼吸机参数变化.结果 患者对Myozyme耐受良好,治疗期间未发生药物不良反应.首次给药第2天肩部压痛感即减轻,随着治疗时间的延长和给药次数的增加,脱机时间延长,原地踏步速度增快和时间延长、双上肢上举力量增加、自主呼吸下行走距离增加和时间延长.疗效评价显示,以治疗7个月时(停药后3个月)疗效佳,至8个月时(停药后4个月)降至治疗前水平;肩部压痛感先改善,也快回复至治疗前水平.结论 Myozyme对依赖呼吸机辅助通气的晚发型糖原贮积病Ⅱ型患者有一定疗效.
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晚发型糖原贮积病Ⅱ型患者呼吸功能临床研究
研究背景 晚发型糖原贮积病Ⅱ型(又称Pompe病)是一种主要累及骨骼肌的全身性遗传代谢性疾病,由溶酶体内酸性α-葡糖苷酶活性缺乏所致.呼吸衰竭是主要死亡原因.方法 对11例经酶学、肌肉病理检查和基因突变分析证实的晚发型Pompe病患者进行立卧位用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气量(FEV1)、大吸气压(MIP)、大呼气压(MEP)和咳嗽峰流速(CPF)测试,与预测值进行对比并计算立位至卧位FVC变化(△FVC)百分比,分析呼吸功能与发病年龄、病程、运动功能、α-葡糖苷酶活性之间的关联性.结果 11例患者均存在肺功能异常,其中立位FVC和FEV1下降者各10例、△FVC下降者8例、MIP下降者11例、MEP下降者10例、CPF下降者10例;卧立位FEV1/FVC均于正常值范围.相关分析显示,立位FVC和△FVC与患者发病年龄、病程、运动功能、α-葡糖苷酶活性不存在关联性.结论 呼吸功能障碍在晚发型Pompe病中较为常见.呼吸功能障碍主要表现为限制型通气障碍,以吸气肌无力突出.
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七例晚发型糖原贮积病Ⅱ型患者临床特征及基因突变分析
目的 分析4个家系7例晚发型糖原贮积病Ⅱ型患者之临床特点和基因型,以提高对该病的认识.方法 收集患者临床资料,并行酸性α-葡糖苷酶(GAA)基因突变分析.结果 7例患者分别来自4个家系,年龄13～31岁、发病年龄6～ 17岁、初诊年龄12～29岁、明确诊断年龄12 ～ 30岁;首发症状为肢带肌萎缩、无力,酸性α-葡糖苷酶活性0～ 5.27 nmol/(mg·h).GAA基因突变分析共发现14种突变,其中2种为新突变位点(Q81X和c.1355_1356delC)、2种假缺陷等位基因位点(G576S和E689K)、8种多态性位点和2种已知的致病突变位点(W746C和D645E).结论 中国大陆地区对糖原贮积病Ⅱ型之诊断时间存在明显的延误,提高医务人员的认识和理解将有助于改善患者预后.在明确诊断糖原贮积病Ⅱ型或判断预后时,应结合临床病史、酸性α-葡糖苷酶活性检测和GAA基因突变分析.糖原贮积病Ⅱ型之临床表型具有异质性,在GAA基因型相同的情况下,同一家系的不同个体间可存在疾病进程和严重程度的差异.
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芪参龟散对Wistar大鼠α-葡萄糖苷酶抑制作用的实验研究
目的 观察芪参龟散对α葡萄糖苷酶的抑制作用.方法 提取Wistar大鼠小肠内表面黏膜的α-葡萄糖苷酶后行酶活力测定,确定佳反应体系,将芪参龟散用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解,过滤,并稀释成不同浓度的溶液,再将同浓度的芪参龟散脱色,并稀释成不同浓度的溶液,同时以阿卡波糖片作为对照药物,观察芪参龟散对α-葡萄糖苷酶的抑制作用.结果 芪参龟散有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用.结论 芪参龟散与阿卡波糖片有相似的降糖作用.
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苦荞提取物抑制α-葡萄糖苷酶的作用
目的:观察苦荞提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响,并与阿卡波糖作用结果进行比较.方法:实验于2003-10/2004-02在解放军总医院营养科实验室完成.①苦荞购自内蒙,苦荞粉碎,用体积分数0.95乙醇回流提取,提取物脱醇浓缩后加水溶解4℃过夜,滤去不溶物,滤液冷冻干燥,得到苦荞提取物.②采用Watanabe等的方法测定苦荞提取物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响.结果:苦荞提取物终浓度为15.625～250 mg/L时,α-葡萄糖苷酶的活性(A值)分别为1.193,1.171,1.067,0.893,0.75;阿卡波糖终浓度为15.625～250 mg/L时,α-葡萄糖苷酶的活性(A值)分别为1.275,1.215,1.097,0.813,0.512.结论:苦荞提取物对α-葡萄糖苷酶的活性有明显的抑制作用,抑制程度与阿卡波糖相当.
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睾丸体积、卵泡刺激素和精浆中性α-糖苷酶在无精子症分型诊断中的应用
世界范围内不孕不育人口约占育龄夫妇的15%,无精子症是男性不育症中较为严重的一种类型,占男性不育的10%~ 20%[1].无精子症分为梗阻性无精子症(obstructive azoospermia,OA)和非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)[2]两种.以往鉴别无精子症类型主要通过睾丸活检、阴囊探查和输精管造影等有创方法,其临床应用受到制约.因此,寻找无创、简便、准确的无精子症分型的诊断方法实属必要.睾丸体积[3]、血清生殖激素[4, 5]和精浆生化[6, 7]检测,因其方便快捷、经济实惠的特点,近年来在男性不育临床治疗中逐渐被重视.本研究采用睾丸体积测量、血清卵泡刺激素(FSH)和精浆中性α-糖苷酶(NAG)3项指标联合对无精子症患者做OA和NOA的分型诊断,探讨无创技术在无精子症鉴别诊断中的应用价值.
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晚发型糖原贮积病Ⅱ型1例患者的临床和病理及其家系GAA基因分析
目的：研究1例晚发型糖原贮积病Ⅱ型(GSDⅡ)患者的临床、病理和遗传特征。方法回顾性分析1例晚发型GSDⅡ患者的临床资料和骨骼肌病理特征，同时取得患者和家属知情同意后对其家系进行遗传咨询，提取外周血白细胞基因组DNA，应用聚合酶链反应(PCR)扩增酸性-α-葡萄糖苷酶(GAA)的基因编码区，直接测序分析GAA基因突变情况。结果①患者男性21岁，临床表现为呼吸肌、四肢近端肌无力。肌电图提示肌源性损害。三角肌病理和免疫组化染色提示肌源性损害，酸性磷酸酶染色(+)。血GAA活性明显低于正常，符合晚发型GSDⅡ诊断。②家系GAA基因分析提示，患者及其父亲和2位姑姑(父亲的妹妹)均携带一个未见报道的GAA基因新突变：位于第8号外显子的缺失突变(p.Met439del)；患者及其母亲、外祖母均携带一个已报道的GAA基因16号外显子错义突变(p.Trp746Cys)；该家系中发现一些非致病性杂合突变。结论在晚发型GSDⅡ家系中发现一个新的GAA基因第8号外显子缺失突变p.Met439del。先证者因存在双杂合突变导致GAA活性下降并出现晚发型GSDⅡ的临床和病理改变。
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婴儿型糖原贮积病 Ⅱ 型基因型表型相关性分析和出生缺陷预防
目的 分析伴有肥厚型心肌病的婴儿型糖原贮积病 Ⅱ 型(GSDⅡ)的基因型和表型特点,以及下一胎出生缺陷的预防方法 .方法对2016年12月 —2017年5月西安市儿童医院心脏内科住院诊断治疗的4例婴儿型GSDⅡ 病儿,进行临床和实验室检查及酸性 α-葡萄糖苷酶(GAA)活性测定,采用Sanger直接测序或二代测序法进行GAA基因突变检测,并对2例先证者母亲下一胎胎儿进行产前GAA基因突变筛查.结果 4例病儿分别在生后2～8月龄出现运动发育迟缓 、肌无力 、心肌肥厚,3例病儿GAA活性分别为2.5、2.1、1.9 nmol/(g·min);4例病儿基因检测发现8个GAA基因致病突变,分别为p.R608X、p.L701P、p.R608X、p.E888X、p.W279C、p.N535Qfs*3、p.S601L、p.E888X.病儿均于确诊后3～6个月死亡.2例进行了下一胎产前诊断,其中1例携带单个杂合突变,顺利分娩,1例携带与先证者相同复合杂合突变,终止妊娠.结论 发病GSDⅡ 病儿分别携带来自父母的致病突变,婴儿型GSDⅡ 病儿症状出现早,未经酶替代治疗死亡率高.GSDⅡ 在我国尚未列入产前筛查,对于病儿母亲下一胎胎儿进行GAA基因检查,有助于GSDⅡ 出生缺陷的预防.
