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PP242对Ph+急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制作用及对AKT1-Ser473磷酸化的影响
目的 观察ATP竞争性哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)抑制剂PP242对体外培养的Ph染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞增殖和AKT1473位丝氨酸磷酸化的影响.方法 对Ph+ ALL细胞株SUP-B15进行培养及传代,Cell Counting Kit-8比色法检测PP242(100 nM,250 nM,500 nM,750 nM,1 000 nM)处理细胞株SUP-B15后12 h、24 h、48 h细胞生长情况；应用免疫印迹法及实时定量RT-PCR检测使用PP242(100 nM,250nM,500 nM)培养细胞48 h后AKT1及磷酸化水平情况.结果 100 nM、250 nM、500 nM、750 nM、1 000 nM PP242对Ph+ ALL细胞株SUP-B15作用12 h、24h及48 h后,其抑制率:12 h组:10.17％,13.25％,20.13％,22.54％,27.61％；24h组:11.33％,20.54％,36.18％,41.66％,47.27％;48 h组:23.13％,39.24％,55.72％,61.88％,66.93％,与对照组相比差异均有统计学意义(P ＜0.05)；100 nM、250 nM、500 nM PP242处理SUP-B15细胞48 h后,免疫印迹法检测结果显示AKT1蛋白的表达水平无明显变化,而473位丝氨酸(Ser473)磷酸化水平逐渐降低；实时定量RT-PCR检测结果显示,AKT1的mRNA表达无明显变化,绝对定量mRNA结果分别为:0.673±0.124,0.751±0.133,0.689±0.154,与正常对照组(0.679±0.167)相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ATP竞争性mTORC2抑制剂PP242对体外培养的Ph+ ALL细胞株SUP-B15细胞的增殖存在抑制作用,其作用强度呈浓度和时间依赖性；SUP-B15细胞中存在AKT1的表达；PP242在抑制Ph+ ALL细胞株SUP-B15细胞的增殖过程中可下调AKT1 Ser473磷酸化水平.
关键词： Ph+急性淋巴细胞白血病 mTORC2 PP242 AKT1 -
pp242对膀胱癌T24细胞增殖及侵袭能力的影响
目的 探讨pp242对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 将T24细胞贴壁培养于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的1640培养液中,37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养.取对数生长期细胞,处理组加入浓度为50、100、200、500 nM pp242;对照组不加药物,每天更换1640 培养液.采用CCK-8法检测各组细胞生长抑制率、transwell小室法检测细胞体外侵袭能力的变化.结果 pp242对T24细胞有显著的增殖抑制作用,transwell法检测pp242处理后的T24体外侵袭能力明显下降,均呈剂量依赖性.结论 pp242对膀胱癌T24细胞具有抑制增殖和侵袭能力的作用,有望成为一种新的膀胱癌治疗药物.
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PP242对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用及GRIM-19表达的影响
目的 观察PP242对体外培养的人晶状体上皮细胞(HLEC)增殖和GRIM-19表达的影响.方法 对永生系人晶状体上皮细胞SRA01/04进行培养及传代,Cell Counting Kit-8比色法检测PP242(100,250,500,750,1 000 nmol/L)处理细胞株SRA01/04后12,24,48 h细胞生长情况；应用免疫印迹法及实时定量RT-PCR检测使用PP242(100,250,500 nmol/L)培养细胞48 h后GRIM-19及其mRNA的表达情况.结果 100,250,500,750,1 000 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞系SRA01/04作用12,24,48 h后,其抑制率12 h组分别为8.59％,14.53％,19.62％,23.01％,28.80％;24 h组分别为10.22％,19.67％,34.92％,42.90％,46.86％;48 h组分别为24.19％,48.13％,54.54％,61.36％,65.34％,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；100,250,500 nmol/L PP242处理人晶状体上皮细胞48 h后,免疫印迹法检测结果显示GRIM-19蛋白的表达水平逐渐增强；实时定量RT-PCR检测结果显示,GRIM-19 mRNA表达增强,绝对定量mRNA结果分别为0.700±0.112,0.994±0.128,1.584±0.173,与正常对照组(0.456±0.177)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PP242对体外培养的人晶状体上皮细胞的增殖存在抑制作用,其作用强度呈浓度和时间依赖性；人晶状体上皮细胞中存在GRIM-19的表达；PP242在抑制人晶状体上皮细胞的增殖过程中可上调GRIM-19的表达.
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PP242对人晶状体上皮细胞凋亡的诱导及凋亡相关蛋白Bax表达的影响
目的 研究PP242对人晶状体上皮细胞(HLECs)凋亡的诱导及凋亡蛋白Bax表达的影响.方法 用不同浓度PP242处理人晶状体上皮细胞系SRA01/04,分别用浓度为0、250、500、750、1 000 nmol/L的PP242处理HLECs 48 h后,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用实时定量PCR及Western blotting方法检测Bax的mRNA及蛋白的表达.结果 250、500、750和1 000 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞系SRA01/04作用48 h后,早期凋亡率分别为7.20％±0.36％、13.77％±0.21％、16.31％±0.20％和18.67％±0.49％,与对照组(0 nmol/L)差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting结果显示,随着PP242浓度的增加,Bax蛋白表达量增加,与对照组(0 nmol/L)比较差异有统计学意义(P＜0.05);实时定量PCR结果显示,Bax mRNA表达量随PP242药物浓度的增加而增加,相对定量mRNA结果分别为2.157±0.125、3.733±0.302、5.596±0.261和7.436±0.167,与对照组(0 nmol/L)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PP242可以诱导HLECs的凋亡,增加其凋亡蛋白Bax的表达.
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PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达的影响
目的：探讨PP242对人晶状体上皮细胞凋亡相关蛋白Bcl?2表达的影响。方法采用不同浓度PP242处理培养传代的永生系人晶状体上皮细胞系SRA01/04。采用MTT法检测处理24、48 h后的细胞生长抑制率，采用实时定量RT?PCR和免疫印迹法检测不同浓度PP242处理48 h后Bcl?2 mRNA和蛋白表达水平的变化情况。结果100、250、500、750、1000、1500 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞SRA01/04作用24、48 h后，细胞生长抑制率24 h组分别为7.55%、9.43%、16.98%、22.64%、26.42%、30.19%，48 h组分别为11.11%、23.81%、36.51%、42.86%、49.21%、63.49%，与对照组（0 nmol/L）比较，差异均有统计学意义（P均<0.05）。免疫印迹法检测结果显示：在相同作用时间内，随着PP242药物浓度的增加，Bcl?2蛋白的表达水平逐步下降，与对照组（0 nmol/L）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。实时定量RT?PCR检测结果显示：在相同作用时间内，随着PP242药物浓度的增加，Bcl?2 mRNA表达水平亦逐步下降；mRNA相对表达量分别为0.723±0.039，0.517±0.028，0.353±0.052，0.167±0.046，与对照组（0 nmol/L）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 PP242能够抑制体外培养的人晶状体上皮细胞的生长，呈浓度和时间依赖性。人晶状体上皮细胞中存在Bcl?2的表达，PP242可下调其表达。
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PP242诱导多囊肾大鼠胆管上皮细胞自噬和凋亡的机制研究
目的 探讨 mTORC1/2 抑制剂 PP242 诱导多囊肾(polycystic kidney,PCK)大鼠胆管上皮细胞凋亡和自噬、抑制细胞增殖及胆管囊性扩张的分子机制.方法 免疫组织化学染色法检测PCK大鼠胆管上皮细胞中p-mTOR和p-Akt的表达;WST-1比色法检测雷帕霉素和PP242对胆管上皮细胞增殖活性的抑制作用,以及LC3、Beclin-1基因沉默和自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对细胞增殖的影响;蛋白免疫印迹法检测PP242 对PI3K/Akt信号通路相关蛋白、自噬标识蛋白 LC3 和 Beclin-1、 cleaved caspase-3表达的影响;流式细胞术和 ELISA 法检测 PP242对细胞凋亡的影响;免疫荧光染色法检测LC3 在细胞质中的表达情况;3D细胞培养检测Rictor基因沉默和雷帕霉素联用及雷帕霉素单独应用时对大鼠胆管上皮细胞成球能力的影响.结果 p-mTOR和 p-Akt在 PCK大鼠胆管上皮细 胞中呈过表达,PP242比雷帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖效果更为明显,且呈浓度和时间依赖性改变(P<0.05);PP242明显抑制PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达;PP242 可诱导细胞凋亡和自噬,上调cleaved caspase-3、Beclin-1 和LC3-II/LC3-I比值. Rictor基因沉默和雷帕霉素联用比雷帕霉素单独应用对大鼠胆管上皮细胞的抑制作用更为明显;LC3、Beclin-1基因沉默和3-MA均可明显减弱PP242对细胞增殖的抑制作用(P <0.05).结论 PP242 可通过 PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的增殖,其机制与细胞凋亡和自噬密切相关.
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mTORC1/2抑制剂与伊马替尼联用抑制Ph+ALL细胞株生长的作用机制
目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C1/2(mTORC1/2)抑制剂PP242与伊马替尼(IM)联用对费城染色体阳性(Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞株SUP-B15的抗白血病作用及机理.方法 以SUP-B15细胞为研究模型,MTT法检测IM与PP242联合处理SUP-B15细胞72 h后的半数抑制浓度(IC50)及联合作用指数(CI);Western blot法检测PP242处理SUP-B15细胞后对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR通路的影响,以及IM与PP242联合处理SUP-B15细胞后对PI3K/Akt/mTOR通路及凋亡相关蛋白的影响.结果 IM单用于SUP-B15细胞的IC50值为(1.50±0.09) μmol/L.而IM与20、30、50 nmol/L PP242联用于SUP-B15细胞,其IG0分别下降为(0.81±0.030) μmol/L、(0.36±0.140) μmol/L、(0.02±0.002) μmol/L,CI值分别为0.764、0.545、0.507,提示两药有较高的协同作用.PP242单独作用于SUP-B15细胞后,磷酸化Akt (p-Akt)、p-4EBP1、p-elF4E、p-ABL、p mTOR、p-P70等PI3K/Akt/mTOR通路上的关键磷酸化蛋白表达下调,且这种变化呈现浓度和时间依赖性.PP242与IM联合用于SUP-B15细胞时,SUP-B15细胞PI3K/Akt/mTOR通路的各关键蛋白下调较PP242或IM单用时更明显,凋亡相关蛋白Bax、cleaved Caspase-3上调也较两药单用时更明显.结论 PP242与IM联合使用时可增强对于PI3K/Akt/mTOR通路的抑制,增加由Bax、Caspase-3所介导的凋亡作用.
关键词： Ph+急性淋巴细胞白血病 mTORC1/2 AKT PP242 伊马替尼
