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Mfn-2沉默对肝癌细胞侵袭及PITPNM3表达的影响
目的 探究Mfn-2沉默对肝癌细胞侵袭的影响及其潜在的分子机制.方法 用Mfn-2-siRNA和siRNA转染SMMC-7721细胞,为Mfn-2-siRNA组和siRNA组,以未经转染的细胞作为对照组.转染48h后,采用荧光倒置显微镜检测转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SMMC-7721细胞中Mfn-2的表达情况,Transwell小室检测SMMC-7721细胞侵袭能力,免疫组化和Western blot检测SMMC-7721细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和磷脂酰肌醇转移蛋白3(PITPNM3)蛋白表达情况.结果 荧光倒置显微镜检测结果显示,转染效率约85％;siRNA组 SMMC-7721细胞中Mfn-2mRNA的表达水平与对照组相比无显著差异(P＞0.05),Mfn-2-siRNA组SMMC-7721细胞中Mfn-2mRNA的表达水平显著低于对照组(P＜0.05);siRNA组SMMC-7721细胞侵袭能力、以及MMP-2和 PITPNM3的表达水平与对照组相比无显著差异(P＞0.05),Mfn-2-siRNA 组 SMMC-7721细胞侵袭能力、以及MMP-2和PITPNM3的表达水平显著高于对照组(P＜0.05).结论 Mfn-2沉默能够增强肝癌细胞SMMC-7721的侵袭能力,推测这一作用是通过上调MMP-2和PITPNM3的表达水平实现的,上述结果为肝癌的治疗和靶向药物的开发提供了一定理论基础.
关键词： 肝癌 线粒体融合蛋白-2 细胞侵袭 基质金属蛋白酶-2 磷脂酰肌醇转移蛋白3 -
线粒体融合蛋白Mfn2对心肌细胞肥大的抑制作用
目的:探讨线粒体融合蛋8-2(mitofusin 2,Mfn2)在心肌细胞肥大时表达的变化,及其对心肌细胞肥大的作用.方法:原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞用苯肾上腺素(phenylephrine,PE)10-5moL/L处理,诱导心肌细胞肥大模型.采用RT-PCR和Western blot方法检测Mfn2基因在肥大心肌细胞中的表达.培养的心肌细胞感染含有Mfn2基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad Mfn2)或对照腺病毒Ad GFP后,给予PE刺激诱导心肌细胞肥大,采用3H-亮氨酸掺人法等方法评价过表达Mfn2对心肌肥大的影响.为了便于显示和分析,本研究将对照组的数据设为1,其他各组数据均为与对照组相比得到的相对数.结果:在PE诱导引起的肥大的心肌细胞中,细胞表面积增加约1倍(P<0.01),与不加刺激的对照组相比,心房利钠因子(atrial natriuretic fact,ANF)表达量也增加了约1倍(P<0.01),而Mfn2的mRNA水平(P<0.01)和蛋白质水平(P<0.01)均明显下降,分别为对照组的50%左右.AdMfn2转染后可检测到心肌细胞中Mfn2的过表达,与对照组Ad GFP(1.72±0.12vs2.47±0.06,P<0.05)相比过表达Mfn2能明显抑制PE引起的心肌细胞蛋白质合成量增加(0.98±0.10vs2.47±0.06,P<0.01)以及心肌细胞面积增大(1.530±0.008vs0.830±0.009,P<0.01).结论:在PE诱导的心肌细胞肥大模型中,Mfn2的基因水平与Mfn2蛋白水平表达明显降低,过表达Mfn2能抑制PE所引起的新牛大鼠心肌细胞蛋白质合成增加和心肌细胞表面积的增大.因此,Mfn2可能是参与心肌细胞肥大过程中的一个重要分子.
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线粒体融合蛋白-2基因增强人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯的敏感性
目的:探讨线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2,Mfn-2)基因表达对人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯敏感性的影响.方法:Real-time PCR检测不同乳腺癌细胞系(T47D、MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435及HCC38)中Mfn-2 mRNA的表达.LipofectamineTM 2000体外转染pEGFP和pEGFP-Mfn-2质粒至人乳腺癌T47D细胞,real-time PCR和Western blotting检测T47D细胞中Mfn-2 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测T47D细胞的增殖,流式细胞术检测T47D细胞凋亡率及线粒体膜电位.结果:与正常乳腺细胞相比,Mfn-2 mRNA在乳腺癌HCC38细胞系中高表达,在T47D等其他细胞系中均低表达.pEGFP-Mfn-2转染48 h后,T47D细胞中Mfn-2 mRNA和蛋白的表达均明显上调.与pEGFP转染组相比,pEGFP-Mfn-2转染组T47D细胞在小白菊内酯(0.05 mol/L)作用下的存活率明显降低[(47.93±2.21)％vs(56.93±2.05)％,P＜0.05].流式细胞术检测结果显示:50 mmol/L小白菊内酯作用下,pEGFP-Mfn-2转染组与pEGFP转染组相比,T47D细胞凋亡率升高[(71.2±2.1)％vs(38.8±2.6)％,P＜0.05],而线粒体膜电位明显降低[(1.6±0.1)％vs(5.0±0.5)％,P＜0.05].结论:pEGFP-Mfn-2转染可增强T47D细胞对小白菊内酯的敏感性.
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EGFR及Mfn2在乳腺癌进展中的意义及其相关性研究
目的 研究外周血线粒体融合蛋白2(Mfn2)在表皮生长因子受体(EGFR)为阳性的乳腺癌患者疾病进展中的表达情况,探讨其与EGFR及乳腺癌预后的关系.方法 选择EGFR阳性乳腺癌患者44例,检测其外周血Mfn2 mRNA表达.随访3年出现疾病进展时,再次检测患者外周血Mfn2 mRNA表达情况.结果 26例患者出现疾病进展,外周血Mfn2阳性表达组疾病进展率为42.1％ (8/19),阴性组疾病进展率为72.0％ (18/25),差异具有统计学意义(P＜0.05);疾病进展后,阳性组Mfn2阳性率降至52.63％ (10/19),阴性组阳性表达率为0％;阳性组出现疾病进展患者阳性率为25.00％(2/8),未进展患者阳性率72.72％ (8/11),差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 EGFR、Mfn2在乳腺癌的复发、转移中发挥重要作用,联合检测EGFR、Mfn2可能作为监测乳腺癌进展、提高乳腺癌复发的诊断效率及预测肿瘤预后的重要生物学指标.
关键词： 乳腺癌 表皮生长因子受体 线粒体融合蛋白-2 免疫组织化学 逆转录-聚合酶链反应 -
膀胱癌组织中 mfn2和 p16的表达变化及意义
目的：观察膀胱癌组织中线粒体融合蛋白-2（ mfn2）、多肿瘤抑制基因1（ p16）的表达变化并探讨其意义。方法65例份膀胱癌组织标本、15例份正常膀胱组织、15例份良性膀胱肿瘤组织标本，用免疫组化法对其mfn2和p16进行检测。结果正常膀胱组织、良性膀胱肿瘤、膀胱癌组织中mfn2阳性表达率分别为13．33％、20．00％、78．46％，p16阳性表达率分别为100．00％、86．67％、33．85％，三种组织中的两个指标的阳性表达率相比，P均＜0．05。膀胱癌组织中mfn2的表达与肿瘤分化程度、TNM分期及生长方式有关（P均＜0．05）， p16的表达与肿瘤TNM分期、肌层浸润有关（P均＜0．05）。结论膀胱癌组织中mfn2阳性表达率升高、p16阳性表达率降低，二者的表达变化可能与膀胱癌的发生、发展有关。
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诺考达唑抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用及机制
目的研究诺考达唑抑制大鼠血管平滑肌细胞( rVSMCs)的作用及机制。方法将rVSMCs分为A、B、C、D 4组,A组常规培养,B组无血清培养24 h,C组无血清培养48 h后常规培养18 h,D组先后加入胸腺嘧啶核苷(工作浓度为0.05 g·mL-1)作用12 h后再加入诺考达唑(工作浓度为0.05 g·mL-1)继续维持12 h。分别进行细胞周期的检测,观察细胞超微结构的变化,检测糖代谢、氨基酸代谢与ATP以及NAD/NADH的变化以及线粒体融合蛋白2( Mfn-2)的表达。结果流式细胞术检测结果显示B、C、D组细胞分别阻滞于G0/G1期,S期及G2/M期。电子显微镜检测显示D组线粒体的数量减少,体积缩小。 D组与 A组及 C组相比,糖代谢、氨基酸代谢均显著降低, ATP 的产生明显减少, NADH的生成显著增加(P<0.05)。 Western Blot示G2/M期细胞阻滞与诺考达唑均可导致Mfn-2表达增高(P<0.05)。结论诺考达唑可明显降低rVSMCs能量代谢,阻断rVSMCs的增殖状态,可能与Mfn-2抗动脉粥样硬化的作用有关。
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转染突变型Notch3基因对线粒体融合蛋白-2表达及下游信号通路的影响
目的 探讨Notch3基因突变后对线粒体融合蛋白-2(mfn-2)的表达及其下游信号通路的影响,从而进一步阐明伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)的病理机制.方法 利用脂质体法将Notch3野生型重组表达质粒(pcDNA3.1-Notch3)、突变型重组表达质粒(pcDNA3.1-Notch3-R90C)以及pcDNA3.1空载质粒分别瞬时转染到人主动脉平滑肌细胞中并培养.Real-time PCR及western-blot检测各组Notch3的表达；Real-time PCR检测各组mfn-2、bcl-2、survivin基因mRNA的表达；Western-blot检测各组mfn-2蛋白的表达；AV/PI双标法检测各组细胞凋亡情况.结果 与空载质粒组和野生型组比较,转染突变型Notch3基因组中mfn-2表达水平明显增加(P＜0.05)、bcl-2和survivin基因表达下调(P＜0.05)以及细胞凋亡明显增加(P＜0.05).结论 Notch3基因突变后引起的mfn2表达上调及下游凋亡调控基因表达失衡可能是CADASIL发病的重要病理机制.
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Ghrelin对球囊损伤大鼠颈动脉后狭窄的影响及机制
目的:观察Ghrelin对球囊损伤大鼠颈动脉狭窄的干预作用,初步探讨其作用机制.方法:选择健康雄性SD大鼠30只,建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型,制模后随机分为假手术组、模型组、Ghrelin组,各为10只.腹腔注射给药30d后取损伤侧颈总动脉,行天狼星红染色并测量管腔面积以判定血管腔狭窄程度;Westernblot检测血管壁Mfn-2蛋白表达.结果:(1)术后30 d,模型组血管内弹力板断裂,内膜及中膜尤其是中膜增生严重,管腔狭窄(46.53±9.78)％,Ghrelin组中膜增生及狭窄程度为(75.62±10.08)％组间比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)(2)球囊扩张损伤颈动脉可明显下调Mfn-2蛋白表达(1.243±0.129)vs(0.634±0.097).Ghrelin则能明显上调Mfn-2的表达(0.824±0.049 vs 0.634±0.097),组间比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:Ghrelin可抑制球囊损伤大鼠颈总动脉所致的管腔狭窄,同时能上调颈动脉平滑肌Mfn-2的表达,Ghrelin可能是通过上调Mfn-2的表达来抑制再狭窄的.
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线粒体融合蛋白-2在肝硬化及慢加急性肝衰竭大鼠中的表达
目的 比较肝硬化、慢加急性肝衰竭和正常大鼠肝组织线粒体融合蛋白2(Mfn2) mRNA和蛋白的表达差异,检测大鼠肝组织中三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)的含量,探讨Mfn2表达差异在肝硬化及肝衰竭发生和发展过程中的意义.方法 通过腹腔注射四氯化碳植物油溶液建立大鼠肝硬化模型,在肝硬化基础上给予LPS/D-Ga急性攻击建立慢加急性肝衰竭大鼠模型,腹腔注射植物油建立正常对照组.正常对照组(NC组,n=10),肝硬化组(LC组,n=15),慢加急性肝衰竭组(LF组,n=15).Western blot法及免疫荧光法观察不同模型组大鼠肝组织中Mfn2的表达,实时荧光定量法检测不同模型肝组织中Mfn2 mRNA的表达,荧光分光光度法测定各组肝组织中ROS含量;生物发光法测定肝组织中ATP含量.数据统计计量资料以均数±标准差(-x±s)表示,样本均数比较用单因素方差分析,变量间相关性应用Pearson相关分析,回归分析采用直线回归方法.结果 Mfn2 mRNA在LC组、LF组肝组织中的的表达显著减低,相对表达量分别为(2.25±0.1)× 106、(0.95±0.5) ×106,与NC组的(2.67±0.4)×106比较,f值分别为-51.75,-6.73,P值分别为0.88、0.001,LC组与NC组比较,差异无统计学意义,LF组与NC组间差异有统计学意义;3组比较,F=451.30,P＜0.05,差异有统计学意义.Mfn2蛋白在LC组、LF组肝组织中的的表达显著减低,相对表达量分别为0.051±0.004、0.037±0.007,与NC组的0.254±0.008比较,t值分别为-19.41、-6.064,P值均＜0.05,差异有统计学意义;3组比较,F=444.98,P＜0.05,差异有统计学意义.与NC组比较,LC组、LS组ATP含量减少,ROS含量明显增加.Mfn2蛋白的表达与ATP含量呈正相关(r=0.982),Mfn2蛋白表达与ROS含量呈负相关(r=-0.803).结论 肝硬化、慢加急性肝衰竭大鼠模型中,肝组织中Mfn2表达降低引起ATP的合成减少,ROS产生增多,Mfn2表达减少与肝硬化、肝衰竭发生过程中能量代谢障碍有关.Mfn2蛋白的表达量与肝损伤程度相关.
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胃促生长素对人主动脉平滑肌细胞增殖及线粒体融合蛋白2表达的影响
目的 通过体外培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs),研究胃促生长素(ghrelin)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及线粒体融合蛋白2(Mfn-2)表达的影响.方法 体外培养HASMCs,第4～6代细胞用于试验.给予不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)的ghrelin 或10-6 mol/L ghrelin不同时间(0、6、12、18、24 h)处理,用四甲基偶氮唑蓝比色(MMT)法观察其对HASMC增殖的影响.RT-PCR,Western blot方法检测不同处理方法对Mfn-2表达的影响.结果 10-7～10-5 mol/L的ghrelin可明显抑制HASMC增殖,浓度为10-6 mol/L抑制作用为明显(P<0.01).ghrelin在6～24 h内均能明显抑制HASMC增殖,在24 h达高峰(P<0.01).10-6 mol/L ghrelin能明显上调Mfn-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01).10-6 mol/L ghrelin在18 h上调Mfn-2 mRNA和蛋白表达的作用为明显(P<0.01).结论 ghrelin可能通过上调Mfn-2的表达来抑制HASMC增殖.
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外周血Mfn2基因表达检测在乳腺癌诊断中的意义
目的 探讨线粒体融合蛋白2 (Mfn2) mRNA在乳腺癌患者外周血中的表达及意义.方法 收集62例乳腺癌患者和25例健康人外周静脉血和组织病理学标本,提取总RNA,检测Mfn2 mRNA以及乳腺癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)的表达.结果0～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者外周血中Mfn2 mRNA阳性率比较,差异有统计学意义(P＜0.05);健康人外周静脉血中Mfn2 mRNA的表达为100％,明显高于其在乳腺癌患者外周血中的表达(P＜0.05);乳腺癌患者组织病理学标本中,EGFR阳性34例,其中外周血Mfn2 mRNA阳性者12例;EGFR阴性28例,其中外周血Mfn2 mRNA阳性者17例.EGFR阳性患者中Mfn2 mRNA的表达率明显低于EGFR阴性者(P＜0.05).结论 乳腺癌患者外周血中Mfn2 mRNA表达阳性率与肿瘤分期、转移和EGFR表达有关.RT-PCR法检测乳腺癌患者外周血Mfn2 mRNA可能有望成为检测乳腺癌细胞微转移的有效方法.
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人线粒体融合蛋白-2基因真核表达载体的构建与鉴定
目的构建人线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2, MFN2)基因真核表达载体并对其进行鉴定。方法在pEGFP-N1载体多克隆位点插入人MFN2基因编码区序列,酶切、测序验证是否插入及正确性。将所构建载体转染原代培养的人血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cel s,VSMCs),荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达；荧光定量PCR和Western blot分别检测MFN2的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了人MFN2基因真核表达载体,其转染VSMCs后,可以检测到MFN2 mRNA及蛋白水平高表达(<0.01)。结论成功构建了人MFN2基因真核表达载体,且能够在原代VSMC中过表达。
