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钩端螺旋体抗原表位预测、重组、表达及免疫原性分析
目的应用生物信息学方法预测两种钩端螺旋体外膜蛋白的表位,结合基因工程手段进行表位重组、表达和免疫原性分析. 方法用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测LipL32和OmpL1的表位,应用PCR技术合成重组表位基因片段,克隆PCR产物构建重组质粒,测序验证.在BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白.纯化该融合蛋白,免疫BALB/c小鼠,显微镜凝集试验(MAT法)测定抗体效价. 结果在LipL32和OmpL1中各预测到2个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段.PCR合成的重组表位基因序列中没有出现移码和碱基置换.纯化后融合蛋白纯度＞90%.融合蛋白产生的抗体效价为75.79,融合头(运载蛋白)抗体效价为10.62. 结论重组表位具有一定免疫原性.为相关蛋白的表位重组和亚单位疫苗等方面的研究打下了良好的基础.
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问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定
目的探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白(MOMP)基因(LipL32),克隆并构建该基因的原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性. 方法常规酚-氯仿法提取上述钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统,不同浓度IPTG诱导后用SDS-PAGE检测rMOMP表达情况.分别用兔抗TR/patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,显微镜凝集试验(MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果. 结果上述17株钩体均有LipL32基因,但可分LipL32/1和LipL32/2两种基因型.13个LipL32/1和4个LipL32/2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.12%～96.60%和97.79%～98.16%.IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的40%和10%.rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR/patocⅠ血清发生结合反应,免疫家兔可对上述17株钩体产生1∶2～1∶64 MAT效价的凝集抗体.1∶2～1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附. 结论所有检测的钩体具有LipL32/1或LipL32/2基因.所构建原核表达系统能表达rMOMP1和rMOMP2.rMOMP1和rMOMP2有良好的免疫原性和免疫反应性.rMOMP1和rMOMP2是具有属特异性的钩体表面外膜蛋白抗原,能诱生交叉凝集、阻断黏附的抗体.
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问号钩端螺旋体病人血清中LipL21抗体检测
寻找钩体属特异性保护抗原,对于研制通用型钩体疫苗及实验室诊断试剂盒均有重要价值.Cullen等[1]首先报告了致病性问号钩体均具有属特异性lipL21脂蛋白基因.我们也曾证实我国15群15型问号钩体参考标准株均含有序列保守的lipL21基因[2].已知钩体病免疫保护作用主要依赖血清抗体为主的体液免疫[3].我们采用显微镜凝集试验(MAT)检测了156份钩体病人血清的凝集效价,并建立rLipL21-IgM/IgG-ELISAs对血清标本中LipL21的IgG和IgM型抗体进行了检测.
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钩端螺旋体疫苗免疫效果玻片凝集试验评价
目的 采用TR/Patoc 1玻片凝集试验(SAT)评价钩端螺旋体疫苗免疫效果及应有价值.方法 采用TR/Patoc 1玻片凝集试验检测100名健康人钩端螺旋体疫苗免疫后的血清抗体变化,并与显微镜凝集试验比较.结果 无论是基础免疫还是加强免疫20d后,玻凝试验抗体阳性率高达90%以上,与标准的显微镜凝集试验比较差异无统计学意义,玻片凝集试验检测的抗体持续时间较短,90d后阳性率已大幅度降低,表明SAT检测的抗体是早期抗体.结论 TR/Patoc 1玻片凝集试验操作简易,可以作为基层卫生机构监测钩端螺旋体疫苗近期免疫效果的方法之一.
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中国15群钩端螺旋体代表菌株分群血清参考品的研制
目的 研制中国15群钩端螺旋体代表菌株的分群血清参考品.方法 制备1批冻干钩端螺旋体15群候选分群参考血清,与国内15株代表菌株进行显微镜凝集试验,同时组织协作标定,并对冻干候选制剂进行稳定性分析.结果冻干的血清候选参考品外观色泽均匀、形态饱满,水分含量均＜3％.每个协作实验室检测结果的室内和室间变异系数(CV)均低于15％.各血清候选参考品于-20 ℃保存24个月的抗体滴度与协作标定及于-20℃保存12个月的结果差异无统计学意义(P＞0.05).结论 研制的中国15群钩端螺旋体代表菌株分群血清参考品具有良好的稳定性,可用于钩体菌株血清分群和菌体疫苗鉴别试验.
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临床标体中钩端螺旋体及其L型的检测与鉴定
目的为探讨钩体L型在钩体病患者体内是否存在及是否具有致病作用.方法对患者血、CSF 进行 MAT;对患者血、CSF及尿液进行钩体及其 L 型培养;对培养出的钩体 L 型进行免疫酶染色、免疫荧光染色、SDS-PAGE、DIBA 及电镜等方法鉴定.结果 MAT 阳性率为19.17%(60/313);钩体普通培养阳性率11.88%(41/345);钩体 L 型阳性率24.93%(86/345).培养出的 L 型经上述方法鉴定为钩体 L 型.结论钩体 L 型培养应与 MAT 及钩体普通培养同时进行,以防漏诊.
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云南省240株钩端螺旋体菌株血清型检定报告
我们对1988年以来从思茅、丽江、临沧、德宏、保山、文山及及玉溪等地州的病人和家、野动物体内分离到的250株钩端螺旋体(以下简称钩体)菌株，于1990～1999年间用显微镜凝集试验和凝集素交叉吸收试验、因子血清、单克隆抗体等方法〔1〕进行血清学分群分型检定。在检定孟连县的75株钩体菌株群别时，发现14株钩体混生株〔2〕，这在国内外尚属罕见。本次检定的250株钩体菌株，除疑似新型菌株已送国家钩体专业实验室复核审定外，现将240株钩体菌株的检定结果报告如下：
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江西省吉水县1999年钩体病暴发流行的调查分析
1999年7月下旬至8月上旬，我省吉水县水田乡发生一起钩体病暴发流行，疫情发生后，我们对该起疫情进行了调查处理，现将结果分析如下。1 材料与方法1.1 对该县集中发生钩体病例的水田乡石鼓、富塘、孔巷、杜下等4个行政村的63例钩体病例进行流行病学个案调查。1.2 收集63例钩体病人的临床资料及有关治疗记录。1.3 采集63例钩体病人的血清，同时采用当今国际上公认的显微镜凝集试验(MAT)和酶免疫斑点试验(Dot-ELISA)进行检测。MAT检测，血清稀释度为1：400；Dot-ELISA检测，血清稀释度为1：10.两种方法同步测定钩体病人抗体水平，同时用MAT方法鉴定钩体血清型。2 结果2.1 基本情况发生疫情的水田乡，地形属山区丘陵，共有14个行政村，人口约16000人，农业以种植水稻为主，间种花生等经济作物，各村环境卫生条件较差。该乡属钩体病老疫区，近一次发生钩体病流行于1994年。2.2 发病情况从7月14日发生首例病人至8月3日止，水田乡石鼓等4个行政村共发生病例63例，其中7月14～26日仅发生病人3例，由于未采取有效预防措施，导致了钩体病发病人数急剧增加，7月27～31日，共发生病例47例，占发病总数的74.60％，为本次钩体病发病的高峰期，平均每天发病9.4例，其中7月31日的11例为发病数高峰，以后发病人数逐渐下降。2.3 发病与年龄、性别的关系 63例病例中，＜20岁年龄组的青少年发病数为38例，占发病数的60.32％(38／63)，20～60岁年龄组的青壮年发病数为24例，占报告发病数的38.10％，60岁以上年龄组为1例，年龄小为7岁，大为63岁；男性26例，女性37例，分别占发病数的41.27％(26／63)和58.73％(37／63)，男女之比为1：1.06.
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钩端螺旋体病显微镜凝集试验影响因素的控制及结果分析
钩端螺旋体病(Leptospirosis,简称钩体病)是致病性钩端螺旋体(Leptospira interrogans,简称钩体)引起的一种分布广泛的人畜共患病.我国是受钩体病危害严重的国家之一[1].我国曾发生过几十次大规模钩体病流行,发病率在10/10万以上的有10次,而9次是洪涝之年[1].20世纪90年代以后,钩体病疫情逐年下降,从2.5941/10万降至2001年0.2984/10万[2].由于本病宿主动物种类繁多[2,3],分布广泛,所以仍然存在着钩体病流行的潜在威胁.
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福建省钩端螺旋体病流行新特点分析
目的 分析福建省钩端螺旋体病(钩体病)流行特点,为防制提供科学依据. 方法 运用流行病学调查方法对2000 -2009年福建省两次钩体病暴发疫情进行统计分析. 结果 闽南某地钩体病暴发疫情是由外来人群因漂流接触疫水发病引起的,发病率44.11％.病人血清阳性率为100％,且早晚期抗体均4倍以上增长.健康人群血清抗体阳性率为26.63％.鼠类是主要传染源.霞浦某地钩体病暴发疫情是由易感人群清理荒芜稻田引发的,发病率61.70％,黄毛鼠是传染源,携带秋季群.病人血清阳性率为89.66％,抗体滴度高达1∶25 600,26例患者早晚期抗体滴度显4倍以上增长,血清群均为秋季群与黄毛鼠携带菌型一致. 结论 漂流和旅游等非耕作性钩体病感染和废弃田再用时引起的钩体感染是福建省21世纪初钩体病局部暴发流行新动向.
