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中国主要问号钩端螺旋体血清群外膜蛋白OmpL1的基因型,原核表达系统构建表达及免疫学鉴定
目的探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在外膜蛋白OmpL1基因,克隆并构建该基因的原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性. 方法常规酚-氯仿法提取上述钩体的基因组DNA,高保真PCR扩增全长OmpL1基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建原核表达系统,不同浓度IPTG诱导后用SDS-PAGE检测重组蛋白rOMPL1表达情况.分别用兔抗钩体TR/PatocⅠ抗原、rOMPL1血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性.分别用显微镜凝集试验(MAT)和钩体细胞黏附模型检测兔抗rOMPL1血清的交叉凝集效价和细胞黏附阻断作用. 结果上述17株钩体均具有OmpL1基因,但至少可分3种基因型:OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3.与文献报道比较,所克隆的OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3基因核苷酸序列同源性分别为93.87%～94.08%、89.82%～100%和80.89%～81.72%,其氨基酸序列同源性分别为93.13%～98.75%、91.87%～100%和85.63%～88.44%.IPTG诱导后pET32a-OmpL1/1-E.coliBL21DE3和pET32a-OmpL1/2-E.coliBL21DE3的rOMPL1/1和rOMPL1/2表达量分别占细菌总蛋白的30%和20%.rOMPL1/1和rOMPL1/2均能与兔抗钩体TR/PatocⅠ抗原血清发生免疫结合反应,免疫家兔可获得抗体.兔抗rOMPL1/1和rOMPL1/2血清对上述17株钩体的MAT效价为1∶2～1∶32,1∶2～1∶16稀释时均能有效地阻断钩体黏附J744A.1细胞. 结论所检测的钩体均有OmpL1基因,但至少可分为3种不同的基因型.所构建的原核表达系统表达的rOMPL1/1和rOMPL1/2具有良好的免疫原性和免疫反应性.rOMPL1/1和rOMPL1/2具有属特异性、钩体表面的膜蛋白抗原,能诱生交叉凝集抗体,并具有钩体黏附阻断的作用.
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我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析
目的 分析我国15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列,构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性,了解lipL21基因自然表达状况.方法 高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Patoc型PatocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段,T-A克隆后测序并构建其原核表达系统.分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性,显微镜凝集试验(MAT)检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价.以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白,用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况.结果 上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.75%～99.82%和99.46%～100%.rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipL21兔抗血清发生结合反应.rLipL21免疫家兔能产生抗体,该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1:16～1:128.问号钩体外膜标本中均可检出LipL21,双曲钩体则否.结论 我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜,双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达.rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性,有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一.
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问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定
目的探讨15群15型问号钩端螺旋体(简称钩体)中国参考标准株及2群2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白(MOMP)基因(LipL32),克隆并构建该基因的原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性. 方法常规酚-氯仿法提取上述钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统,不同浓度IPTG诱导后用SDS-PAGE检测rMOMP表达情况.分别用兔抗TR/patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Western blot鉴定其免疫反应性和免疫原性,显微镜凝集试验(MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果. 结果上述17株钩体均有LipL32基因,但可分LipL32/1和LipL32/2两种基因型.13个LipL32/1和4个LipL32/2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.12%～96.60%和97.79%～98.16%.IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的40%和10%.rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR/patocⅠ血清发生结合反应,免疫家兔可对上述17株钩体产生1∶2～1∶64 MAT效价的凝集抗体.1∶2～1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附. 结论所有检测的钩体具有LipL32/1或LipL32/2基因.所构建原核表达系统能表达rMOMP1和rMOMP2.rMOMP1和rMOMP2有良好的免疫原性和免疫反应性.rMOMP1和rMOMP2是具有属特异性的钩体表面外膜蛋白抗原,能诱生交叉凝集、阻断黏附的抗体.
