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工程酵母细胞高压破碎、蛋白低温保藏和去糖基化处理对7-木糖紫杉烷糖基水解酶LXYL-P1-2活性的影响
紫杉醇主要来源于红豆杉，作为一种“重磅炸弹”式的抗肿瘤药物，自1992年12月被美国 FDA批准上市以来，一直是销售额大的植物抗肿瘤药。但由于紫杉醇的天然含量极低，约占含量高的树皮部位的万分之二，加之红豆杉生长缓慢，早期从野生红豆杉中获取紫杉醇曾给红豆杉资源造成毁灭性破坏。目前主要依靠化学半合成或苗圃栽培手段制取。苗圃栽培虽然对保护野生红豆杉资源具有积极意义，但栽培红豆杉中紫杉醇含量低微的本质没有发生改变。另一方面，红豆杉中存在着大量的紫杉醇结构类似物，其中包括含量数十倍于紫杉醇的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇，而后者在脱除木糖基之后形成的10-去乙酰紫杉醇仅需在 C10位乙酰化即可产生紫杉醇[1]。如能将这类副产物转变成紫杉醇，不仅可以减少其对环境的污染，还可以“变废为宝”，大大提高红豆杉资源的利用率。脱除木糖基可用化学法或生物酶法来完成，其中后者的专一性强、环境友好。但由于天然细胞中β-木糖苷酶的酶量普遍偏低，用筛选得到的微生物直接进行转化效率不高[2-3]，本实验室已尝试用基因工程方法解决这一问题。我们已从具有转化7-木糖-10-去乙酰紫杉醇为10-去乙酰紫杉醇能力的真菌香菇中克隆得到了7-木糖紫杉烷糖基水解酶 LXYL-P1-2，该酶隶属于糖基水解酶的第3家族，是一种全新的和双功能的β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，能高效且专一性地水解包括7-木糖-10-去乙酰紫杉醇在内的7-木糖紫杉烷的木糖基，生成相应的7-羟基紫杉烷。已对该酶及其重组菌开展了酶的表征、高密度发酵与生物催化等研究[4-6]。本文报告工程酵母细胞高压破碎条件、蛋白低温保藏和去糖基化处理对 LXYL-P1-2酶活性的影响，为利用纯化的重组酶进行酶结构与功能关系等的研究提供保障。
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(-)表没食子儿茶素没食子酸酯增强阿糖胞苷对HL-60细胞的抗肿瘤活性
目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)增强阿糖胞苷(AraC)对人白血病HL-60细胞的抗肿瘤活性.方法:采用生长曲线法、MTT法测定细胞增殖;以流式细胞光度仪分析联合用药对细胞周期和细胞凋亡的影响;以对消实验研究EGCG能否逆转脱氧胞苷(dCdR)的补救作用;以Western blot和细胞内钙测定探讨EGCG和AraC联合作用的分子机制.结果:合并EGCG能增强AraC对HL-60细胞的增殖抑制作用,倍增时间从48 h延长到70 h,生长饱和密度从5.78减少到5.54;合并EGCG后,AraC抑制HL-60细胞的增殖,IC50从(0.34±0.29)μmol/L减少到(0.11±0.09)μmol/(P＜0.05).AraC可使HL-60细胞阻滞于G1期,S期细胞减少,低浓度的EGCG对细胞周期几乎无影响,但增强了AraC的细胞周期阻滞作用及细胞凋亡作用;对消实验表明单用AraC的IC50为0.03μmol/L,加上dCdR后IC50为0.02 mmol/L,而在给予EGCG后IC50减少到4.8 μmol/L;EGCG可增强AraC引起的bcl-2蛋白表达的下调,进一步升高AraC引起的肿瘤细胞内Ca2+浓度的增加.结论:AraC合并应用EGCG可增强对人白血病HL-60细胞的抗肿瘤活性.
