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铜绿假单胞菌重组Bb-OprI疫苗诱导小鼠保护力和脾细胞因子基因表达变化的研究
目的 研究铜绿假单胞菌重组Bb-OprI疫苗免疫及PA01株攻击后,小鼠肺组织细菌菌落计数和脾细胞因子 IL-2、IFN-γ和IL-12基因表达的变化. 方法 取5×109个CFU Bb-OprI疫苗灌胃接种BALB/c鼠,每周3次,连续接种3周.首次免疫后4周,用5×106个CFU的PA01株滴鼻攻击.攻击后2周处死小鼠,取肺脏,经常规培养后计数菌落数;取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,用PaAg刺激培养,48h后收集脾细胞,PCR扩增IL-2、IFN-γ和IL-12基因. 结果 Bb-OprI疫苗组、空载体对照组和Bb对照组小鼠肺组织菌落数分别为(0.46±0.09)×108 CFU、(5.42±0.79)× 108 CFU和(6.20±0.95)×108 CFU,差异有统计学意义(P＜0.01);疫苗组小鼠脾细胞扩增出453bp的IL-2基因、399 bp的IFN-γ基因和300bp的IL-12基因,两对照组PCR扩增均阴性. 结论 重组Bb-OprI疫苗可诱导小鼠脾细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-12基因表达升高,产生Th1型免疫应答从而抵抗Pa的感染.
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日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的构建及鉴定
目的 构建并鉴定日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bb)(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗. 方法 从本室保存的BL21(DE3) (pET28α-Sj26GST-Sj32)重组菌中抽提质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,PCR扩增Sj26GST-Sj32融合基因,将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32.将此重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,抽提质粒并进行BamH Ⅰ及EcoR Ⅰ双酶切,鉴定载体片段及目的基因片段长度.用电穿孔法将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32转化至Bb,构建重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32),抽提质粒,进行PCR鉴定. 结果 PCR成功扩增出长度为1 991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因；双酶切证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入质粒pGEX-1λT中；PCR证实从重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗中扩增出1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因. 结论 成功构建重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗.
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日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导小鼠脾细胞增殖、凋亡及亚群变化的研究
目的 探讨日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗诱导BALB/c鼠脾细胞增殖、凋亡及亚群的动态变化.方法 将88只BALB/c小鼠随机分为2组,每组44只,分别经口服和滴鼻接种日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周每组剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,经SjAWA刺激培养(设原液和ConA刺激对照组)后采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测脾细胞增殖情况;经Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)双染色后采用流式细胞仪检测脾细胞凋亡率;采用流式细胞仪检测免疫小鼠脾CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群百分比.结果 口服组和滴鼻组小鼠脾细胞增殖均于免疫后6周(口服组原液、SjAWA刺激及ConA刺激时分别为0.609±0.144、0.638±0.013及0.638±0.013;滴鼻组三者分别为:0.687±0.009、0.705±0.006及0.728±0.002)达高峰;口服免疫组小鼠脾细胞凋亡率无论有无刺激物作用,均在免疫后4周(原液和ConA刺激组峰值分别为0.092±0.005和0.126±0.002)达高水平,而滴鼻免疫组在免疫后8周(原液和ConA刺激组峰值分别为0.086±0.005和0.109±0.008)达峰值;口服组CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群分别于免疫后6周(0.321士0.001)和8周(0.080±0.001)达峰值,滴鼻组CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群分别于免疫后8周(0.327±0.010)和12周(0.082±0.002)达峰值,口服组较滴鼻组峰值提前.结论 日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗可诱导小鼠脾淋巴细胞增殖、T细胞亚群升高和抑制脾细胞凋亡,产生有效的免疫应答.
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两歧双歧杆菌86321生长特性的研究
目的 研究两歧双歧杆菌86321的生长特性,为该菌生理功能研究和高效发酵剂的研制提供理论依据.方法 通过生长曲线、产酸量、适厌氧方式、适pH、适培养温度及适接种量等一系列实验,对两歧双歧杆菌86321进行生长特性的研究.结果 两歧双歧杆菌86321在BL培养基中培养时间可缩短至16h,高活菌数的lg值达到9.5；其适厌氧方式为自然厌氧法或密封法,装液量视实际情况而定；在pH 7.0 ～8.0生长良好,适初始pH为8.0；在37 ～42℃生长良好,适温度为37℃；综合总菌量和生产成本,确定适接种量为7%(υ/υ).结论 用BL培养基可以大大提高两歧双歧杆菌86321的产量.细菌产量的高低和发酵速度的快慢与菌种活力、厌氧方式、培养温度及pH等因素密切相关.
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1株新分离的人两歧双歧杆菌耐药性研究
目的研究新分离的人两歧双歧杆菌对11种抗生素的耐药性.方法采用琼脂扩散纸片法测定人两歧双歧杆菌对11种抗生素的敏感性,通过在双歧杆菌培养基中添加不同浓度的抗生素来确定MIC值.结果该菌株对β-内酰胺类、大环内脂类和利福平非常敏感,对氨基糖苷类、黄胺类表现出较强抗性.结论该菌株对11种抗生素的药物敏感性与国内外其他文献所报道的结果一致.但该菌株带有一22kb大小的天然质粒,需进一步研究质粒与其耐药性的关系.
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双歧杆菌在家兔实验性肝坏死模型中的靶向增殖研究
目的探讨双歧杆菌在海扶超声聚焦刀(HIFU)制作的肝凝固性坏死模型中的靶向性增殖的可能性.方法用HIFU制作成家兔肝凝固性坏死模型,经耳缘静脉注射两歧双歧杆菌活菌,通过检测注射前后家兔体温、红细胞、白细胞和血小板等生理指标的变化和注射后主要器官的组织切片来评价双歧杆菌作为基因治疗载体系统的安全性,同时对肝坏死模型等组织切片还做了革兰染色检测,证明了双歧杆菌在坏死组织中的增殖.结果双歧杆菌能够在HIFU制作的肝凝固性坏死模型中增殖、而这一增殖过程并不影响家兔的生命安全.结论双歧杆菌作为肿瘤基因治疗的靶向载体系统是安全和可行的,HIFU制作的肝坏死模型可以用于双歧杆菌基因治疗的靶向载体系统的辅助研究.
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一株携带质粒的人两歧双歧杆菌的分离与鉴定
目的:分离携带天然质粒的人双歧杆菌.方法:用自制的改良型Blb双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离双歧杆菌,对初步质粒检测阳性的单菌落通过糖发酵试验、(G+C)mol%测定和16S rDNA序列分析,进行菌株鉴定.结果:筛选到一株携带天然质粒的人双歧杆菌,编号B200304,在1.0%琼脂糖凝胶上,测得质粒的相对分子质量约为22 kb.通过对该菌株的形态学观察和糖发酵试验等生理生化特征研究,证明该菌株为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum);HPLC法测得其(G+C)mol%为55.6,16SrDNA序列分析进一步证实该菌株为两歧双歧杆菌.结论:分离得到一株携带天然质粒的人两歧双歧杆菌新菌株.
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两歧双歧杆菌对菌群失衡大鼠类风湿关节炎的调整作用
目的 探讨两歧双歧杆菌对菌群失衡大鼠类风湿关节炎(RA)的调整作用.方法 首先利用抗生素头孢曲松钠灌胃的方法建立大鼠(SPF级雌性Wistar大鼠20只)肠道菌群失衡模型,在此基础上采用牛Ⅱ型胶原诱导方法建立大鼠RA (CIA)模型,然后分为模型组和两歧双歧治疗组,3周后,观察两组大鼠关节肿胀程度,血清中IgG、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17、1L-4、IL-10的变化及血清中SOD、MDA和滑膜液中SOD的变化.结果 与模型组相比,治疗组的关节肿胀评分有降低趋势;血清中的IgG(t=6.0114,P=0.0002)、IL 1β(t=6.6719,P=0.0001)、TNF-α(t=3.8461,P=0.004)和IL-17(t=4.6894,P=0.001)的含量明显降低,IL-6略有降低,IL-4和IL-10都有所升高;血清中的SOD活力有所升高,MDA含量有所降低,滑膜液中的SOD(t=-2.4793,P=0.038)活力明显升高.结论 两歧双歧杆菌能够减缓炎症和降低氧化压力,从而出现减轻关节肿胀、延缓RA发展的趋势.
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日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌pGEX-Sj14-3-3疫苗免疫BALB/c小鼠脾细胞凋亡的动态观察
目的 探讨日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)pGEX-Sj14-3-3疫苗对BALB/c小鼠脾细胞凋亡的影响.方法 96只BALB/c小鼠按体质量分为2组,每组48只,用重组Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗分别经口服灌胃和鼻腔黏膜两种途径免疫小鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22周各剖杀4只小鼠,取脾并分离脾细胞,两种免疫途径均分别用或不用刀豆蛋白A(ConA)刺激培养脾细胞,采用流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率.结果 未刺激时,口服灌胃(PO)组和鼻腔黏膜(IN)组小鼠的脾淋巴细胞凋亡水平在免疫后2～4周(PO组:0.069±0.005、0.076±0.010;IN组:0.037±0.002、0.075±0.002)显著升高,在免疫后4周达峰值(P均＜0.05)；ConA刺激时,两组小鼠的脾淋巴细胞凋亡水平在免疫后2～6周(PO组:0.089±0.006、0.098±0.010、0.060±0.007; IN组:0.054±0.001、0.093±0.003、0.058±0.012)升高,在4周达峰值(P均＜ 0.05)；每组ConA刺激时脾细胞凋亡发生率均明显高于相应的原液组(P均＜0.05).结论 重组Bb (pGEX-Sj14-3-3)疫苗口服及鼻腔黏膜免疫小鼠可抑制脾细胞发生凋亡.
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日本血吸虫重组两歧双歧杆菌疫苗的构建及其表达
目的 构建及鉴定日本血吸虫(Sj)重组两歧双歧杆菌(Bb)疫苗[Bb (pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3)],并研究融合基因Sj26GST-Sj14-3-3在Bb中的表达情况.方法 将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3电转化至Bb中,构建重组Bb (pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3)疫苗,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用双酶切和聚合酶链式反应(PCR)鉴定重组Bb (pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3)疫苗,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法对表达产物进行鉴定.结果 双酶切及PCR证实重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3成功转入Bb中.SDS-PAGE鉴定结果显示,诱导表达产物是相对分子质量约为67×103的重组蛋白,与预期结果相符.蛋白免疫印迹法鉴定结果显示,重组蛋白能被sj感染的兔血清所识别.结论 成功构建Sj重组Bb (pGEX-Sj26GST-Sj14-3-3)疫苗,Bb可表达具有特异抗原性的Sj26GST-Sj14-3-3重组蛋白.
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日本血吸虫重组两歧双歧杆菌pGEX-Sj14-3-3疫苗构建及鉴定
目的 构建日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)pGEx-Sj14-3-3疫苗,并进行鉴定.方法 从日本血吸虫成虫中提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因.将Sj14-3-3基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3.用重组质粒将大肠埃希菌BL21(DE3)转化为感受态细胞,抽提重组质粒进行双酶切,鉴定载体片段和基因片段长度:采用电穿孔法,用重组质粒pGEX-Sj14-3-3转化Bh,构建Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗,抽提疫苗的质粒进行PCR鉴定,比较重新构建的pGEX-Sj14-3-3基因片段长度与日本血吸虫成虫中Sjl4-3-3基因片段长度是否相同.结果 RT-PCR扩增出的日本血吸虫成虫Sj14-3-3基因片段长度为399 bp;双酶切鉴定,重组质粒pGEX-Sj14-3-3载体片段长度为4947 bp,Sj14-3-3基因片段长度为399 bp;在重组的Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗中,得到Sj14-3-3基因片段长度为399 bp,与预期的结果一致.结论 成功构建了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗.
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日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj32)疫苗构建及鉴定
目的 构建和鉴定日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)pGEX-Sj32疫苗.方法 从重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所构建的重组大肠埃希菌BL21 (pET28α-Sj32)中抽提质粒pET28α-Sj32,通过PCR扩增Sj32抗原编码基因;将Sj32基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj32,将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞(DE3),抽提质粒后进行双酶切鉴定;采用电穿孔法,将重组质粒pGEX-Sj32转化至Bb,构建Bb(pGEX-Sj32)疫苗,再从该疫苗中抽提重组质粒pGEX-Sj32,以其为模板进行PCR鉴定.结果 从抽提质粒pET28α-Sj32中PCR扩增出长度约为1 270 bp的Sj32基因片段;重组质粒pGEX-Sj32经双酶切鉴定,获得长度为4 947 bp的载体片段和长度为1 270 bp的Sj32基因片段;以抽提的疫苗质粒pGEX-Sj32为模板进行PCR扩增,得到了长度约为1 270 bp的Sj32基因片段,与预期结果相符.结论 成功构建了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗.
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两歧双歧杆菌对鼠伤寒沙门菌感染小鼠TNF-α水平的影响
目的 以鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium,STM)感染小鼠为模型,研究两歧双歧杆菌(Bifidobacterim bifidum,B.bifidum)对STM感染小鼠TNF-α水平的影响.方法 先用硫酸链霉素给正常小鼠灌胃2 d,出现菌群失调症状,再通过STM灌胃感染小鼠,使用两歧双歧杆菌液干预治疗STM感染小鼠,检测不同治疗时间各组小鼠肝脾指数、血及脾中TNF-α的含量.结果 随着治疗天数的增加,STM感染各组与正常组小鼠体内血及脾中TNF-α的含量均有明显差异;STM感染各组中,未干预组、生理盐水组及双歧杆菌组脾中TNF-α的含量有显著变化;其中,双歧杆菌组的TNF-α水平明显升高.结论 两岐双歧杆菌对STM感染机体的TNF-α分泌有一定促进作用.
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日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj32）疫苗诱导BALB/c鼠脾细胞增殖、亚群及细胞因子的动态变化
目的：观察日本血吸虫重组Bb（pGEX-Sj32）疫苗诱导免疫鼠脾细胞免疫应答的动态变化，探讨该重组疫苗的免疫机制。方法88只BALB/c鼠随机分为口服组和滴鼻组，口服组小鼠经口服单次接种106克隆形成单位（CFU）重组疫苗，滴鼻组小鼠经滴鼻单次接种105 CFU重组疫苗；于免疫后0~20周内间隔2周每组随机剖杀4只小鼠，取脾并制备脾细胞悬液，分别经未刺激（脾细胞悬液）、SjAWA刺激和ConA刺激培养。MTT法检测脾细胞增殖效率，流式细胞术检测脾CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群变化，双抗体夹心ELISA法检测培养上清液中TNF-α、IL-10和IL-12表达水平。结果与0周相比，未刺激、SjAWA刺激和ConA刺激时，口服组和滴鼻组脾细胞均分别在免疫后2~16周和2~18周发生极显著增殖（P<0.01）；两组CD4+T细胞亚群均于免疫后2~12周显著升高（P<0.01），CD8+T细胞亚群在观察期间升高不明显；不同培养条件下，口服组脾细胞因子TNF-α、IL-10和IL-12水平均分别在免疫后2~14周、2~18周和2~14周升高，于8周、10周和6周达峰值；滴鼻组3者分别在免疫后2~14周、2~18周和2~18周升高，于8周、10周和8周达峰值。结论日本血吸虫重组Bb（pGEX-32）疫苗可诱导小鼠产生有效的免疫应答。
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日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj26GST)疫苗的构建及鉴定
目的 构建日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj26GST)疫苗,并对其进行鉴定.方法 采用RNeasy Mini试剂盒提取日本血吸虫成虫总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得Sj26GST抗原编码基因;将该编码基因与pGEX-1λT载体进行连接,得到重组质粒pGEX-Sj26GST,并对其进行双酶切鉴定;将重组质粒电转化入两歧双歧杆菌中,构建重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj26GST)疫苗,PCR鉴定疫苗.结果 RT-PCR扩增出的日本血吸虫成虫Sj26GST基因片段长度为676 bp;双酶切证实Sj26GST抗原编码基因成功插入pGEX-1λT载体中;PCR证实从重组两歧双歧杆菌疫苗中扩增出长度为676 bp 的Sj26GST基因片段.结论 成功构建了日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj26GST)疫苗.
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铜绿假单胞菌重组Bb-pGEX-OprI疫苗的构建及其保护力的研究
目的 构建并鉴定含有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)外膜蛋白I(OprI)基因与两歧双歧杆菌(Bi idobacterium bi idum,Bb)疫苗(Bb-pGEX-OprI),并研究该疫苗对小鼠Pa感染的保护作用.方法 PCR扩增OprI抗原编码基因并将其定向克隆至pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprI,将pGEX-OprI电穿孔转化Bb,构建Bb-pGEX-OprI疫苗,进行双酶切、PCR和测序鉴定后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分别分析并鉴定表达产物.21只小鼠随机分为3组,分别灌胃接种Bb-pGEX-OprI疫苗、空载体疫苗(Bb-pGEX-1λT)和Bb.首次免疫后4周用PA01株攻击.攻击后2周处死小鼠取肺组织,计数肺组织的细菌菌落数.免疫前、首次免疫后4周和PA01株攻击后2周采小鼠静脉血,常规ELISA检测血清IgG及其亚类和IgE.结果 PCR成功扩增出194 bp的OprI抗原编码基因;双酶切、PCR和测序证实OprI基因成功克隆入pGEX-1λT中,并且pGEX-OprI成功转化Bb,构建为Bb-pGEX-OprI疫苗;SDS-PAGE显示Bb-pGEX-OprI表达相对分子质量约32×103的OprI-谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白;Western blot证实融合蛋白能被Pa感染的鼠血清特异性识别.Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠肺组织的细菌菌落数低于Bb-pGEX-1λT组和Bb组(P＜0.01),Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠血清IgG、IgG2b、IgG3和IgE水平在首次免疫后4周和攻击后2周依次升高,相同时间点Bb-pGEX-OprI疫苗组小鼠血清抗体水平均高于Bb-pGEX-1λT和Bb组(P＜0.01或P＜0.05).结论 成功构建了重组疫苗Bb-pGEX-OprI,其在小鼠抗Pa感染过程中可产生有效的体液免疫应答.
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两歧双歧杆菌介导的铜绿假单胞菌外膜蛋白Ⅰ(Bb-OprⅠ)疫苗免疫增强小鼠对铜绿假单胞菌的抑制作用
目的 研究两歧双歧杆菌介导的铜绿假单胞菌外膜蛋白Ⅰ(Bb-OprⅠ)疫苗免疫及PA01株铜绿假单胞菌攻击后,小鼠肺细菌负荷和脾细胞的增殖、T细胞亚群分布及细胞凋亡情况.方法 将5×109个菌落形成单位(CFU)疫苗灌胃接种BALB/c小鼠,每周3次,连续接种3周.在首次免疫后4周,用5×106个CFU的PA01株滴鼻攻击.在攻击后2周,处死小鼠取肺和脾脏,计数肺细菌负荷;MTT法检测脾细胞增殖,流式细胞术检测脾CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群及脾细胞凋亡率.结果 Bb-OprⅠ疫苗免疫及PA01株铜绿假单胞菌攻击后,小鼠肺细菌菌落数减少,脾细胞增殖和CD4+T细胞比例明显增加,细胞凋亡明显减少.结论 重组Bb-OprⅠ疫苗灌胃接种可增加CD4+T细胞比例,增强对铜绿假单胞菌的抑制作用.
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两歧双歧杆菌对鼠伤寒感染小鼠模型的生物治疗作用
目的:研究两歧双歧杆菌在体内对鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium, STM)感染小鼠的治疗作用.方法:先用硫酸链霉素给正常小鼠灌胃2 d,出现菌群失调症状,再用STM灌胃造成小鼠STM感染,使用两歧双歧杆菌液干预治疗STM感染小鼠,检测不同治疗时间各组小鼠粪便STM菌落数.结果:随着治疗天数的增加,STM菌落数逐渐减少,未干预组、生理盐水组及双歧杆菌组STM菌落数差异均有统计学意义(P＜0.01),其中双歧杆菌组STM菌落数下降快.结论:双歧杆菌对小鼠STM感染有治疗作用.
